《Biofabrication》：3D打印助力“鱼鳞明胶”新应用可用作骨修复

来源：EngineeringForLife  

开发适用于生物制造和模拟细胞外基质物理化学特性的生物材料墨水对于组织工程应用中的生物打印技术至关重要。使用动物来源的蛋白质材料，如水母胶原蛋白或鱼鳞(FS)明胶，已成为生物材料墨水设计的重要支柱，以提高水凝胶的生物活性。然而，除了提取蛋白质结构外，由于其有机（胶原蛋白）和无机（羟基磷灰石）含量，使用结构完整的FS作为添加剂可以提高水凝胶的生物相容性和生物活性，同时提高3D打印应用中的机械强度。

为了检验这一假设，来自伊利诺伊理工学院的Funda Tihminlioglu联合埃尔朗根-纽伦堡大学的Aldo R Boccaccini团队展示了一种由FS和藻酸盐二醛明胶(ADA-GEL)组成的复合生物材料墨水，用于3D生物打印应用（图1）。由于水凝胶显着增加的刚度和支持的骨诱导性，作为天然胶原蛋白和羟基磷灰石来源的FS结构有助于骨工程应用的生物材料墨水特性。FS微粒是胶原蛋白和羟基磷灰石的天然来源（图 1B），用作生物相容性添加剂，ADA-GEL 用作水凝胶基质（图1C）。

相关研究成果以“Fish scale containing alginate dialdehyde-gelatin bioink for bone tissue engineering”为题于2023年1月27日发表在《Biofabrication》上。

图1 含有前成骨细胞 MC3T3-E1 细胞的 ADA-GEL/FS 生物墨水示意图

1. 3D打印的ADA-GEL/FS水凝胶
含有1%、3%、5% 和 10%（重量百分比）FS 颗粒的 3D 生物打印 ADA-GEL/FS 水凝胶很容易制成具有10层的圆形。图2A-C显示了分别使用氯化钙和mTG交联后细丝形成、印刷ADA-GEL/FS结构和印刷水凝胶结构的优化。印刷结构的光学显微镜图像表明所有组都具有形状保真度和链之间的方形大孔。ADA-GEL/FS的可打印性根据 Pr 因子、U 因子、孔径和线直径进行评估。（图2D-F）。此外，制造的支架的孔径随着 FS 浓度的增加而减小（图2G）。

图2 3D打印水凝胶复合支架

SEM显示在ADA-GEL基质中掺入FS颗粒会增加表面的粗糙度（图3A）。通过增加颗粒浓度和掺入 ADAGEL 结构来改变支架的表面形态FS 颗粒的胶原含量及其纤维结构会影响表面形态，从而导致表面粗糙度增加。颗粒与 ADA-GEL 相互作用的区域和结构中颗粒的纤维结构如图3B所示。明胶和胶原蛋白的相同化学成分使 ADA-GEL 和 FS 颗粒之间具有良好的相互作用，并具有适当的界面相互作用。

图3 3D打印FS增强型ADA-GEL支架

2. FS颗粒的添加提高了机械性能
通过应力松弛试验研究了掺入FS的ADA-GEL水凝胶的机械性能。为机械测试准备的水凝胶的光学显微镜图像如图4A所示，测试结果表明ADA-GEL的刚度和杨氏模量最低，松弛速度最快。将FS掺入ADA-GEL基质中可显着提高刚度，从而提供复合结构，SEM图像证实了这一点（图4B）。与其他组相比，在 10%FS掺入组中发现更高的压应力。随着颗粒浓度的增加，水凝胶的应力松弛得到显着改善。水凝胶的杨氏模量根据颗粒浓度而增加，在ADAGEL/10%水凝胶中，较高的模量记录为 96±8kPa，与其他组相比存在统计学差异（图4D）。

图4 复合水凝胶的机械性能

3. ADA-GEL/FS组合物增加生物活性
ADA-GEL/FS 支架的生物活性通过SEM、EDX和FTIR分析进行评估。通过在SBF中形成矿化CaP涂层的沉积。EDX分析证实了支架表面的CaP层形成，显示了形成层表面的钙 (Ca)、氧 (O) 和磷 (P) 元素（图6B）；FTIR光谱表明复合支架表面形成了碳酸盐和磷酸盐。结合 SEM、EDX 和 FTIR 结果，可以证实ADA-GEL/FS 水凝胶具有生物活性，生物活性随着 FS 颗粒的添加增加了CaP的形成。

图5 ADA-GEL/FS复合支架的生物活性研究

4. 水凝胶的细胞培养
接着，作者进行体外细胞培养研究以研究MC3T3-E1前成骨细胞在生物制造的ADA-GEL/FS复合水凝胶中的活力、形态、增殖和生物活性。通过活/死染色测定法评估细胞的活力，染色结果表明细胞在14天后在掺入FS的生物墨水组合物中存活并保持其活力（图7A）。活细胞（绿色）扩散并覆盖水凝胶表面，在细胞培养期间甚至培养后期观察到少量死细胞（红色）。此外，细胞活力被确定为超过 90%（图7），这表明生物墨水组合物具有生物相容性适合细胞生长。此外，细胞培养表明MC3T3-E1前成骨细胞在14天的培养中保持活力，没有任何细胞毒性作用（图7C-D）。

图6 纯ADA-GEL和FS掺入ADA-GEL细胞水凝胶的细胞毒性评估

5. ADA-GEL/FS水凝胶诱导成骨分化
通过光学显微镜（图7A）和活/死染色（图7B）观察到FS颗粒上的细长和扩散细胞显示出细胞-颗粒相互作用 MC3T3-E1 细胞在聚合物基质内部和 FS 表面附着并增殖。由于 ADA-GEL/FS 水凝胶有利的微环境，细胞会在细胞培养期间粘附在结构上并在水凝胶基质内生长。同时，作者在28天的培养期间，根据ALP活性（图7C）和OC分泌（图7D）评估生物打印ADA-GEL/FS水凝胶内MC3T3-E1细胞的分化。

图7 3D 生物打印水凝胶内的MC3T3-E1细胞和FS颗粒相互作用以及ADA-GEL/FS生物打印水凝胶的分化研究

综上，本文介绍了一种由ADA-GEL和FS颗粒组成的生物墨水配方，作为骨再生的有潜力的候选材料。在材料特性、细胞相容性和成骨分化方面研究了将FS 颗粒添加到 ADAGEL 基质中的影响。FS 颗粒均匀分布到 3D 生物打印的水凝胶中，并显示出与 ADA-GEL 的适当相互作用。生物打印的ADA-GEL/FS 复合水凝胶表现出生物活性以及对MC3T3-E1细胞有利的微环境。此外，FS 颗粒的掺入还增加了前成骨细胞的细胞增殖和成骨分化。细胞相容性、与骨骼相似的生化成分、独特的胶原纤维取向、羟基磷灰石含量的天然生物矿化能力以及方便的印刷特性使ADA-GEL/FS 成为一种很有前途的骨修复生物材料。

文章来源：
https://iopscience.iop.org/article/10.1088/1758-5090/acb6b7