中国科学院大学：3D打印高保真度、结构稳定和细胞定向的人造结缔组织

来源： EngineeringForLife

制造具有高打印保真度、结构稳定性、生物相容性和细胞定向的结缔组织对于生物墨水仍然是一项挑战。胶原蛋白，作为提供体内强度的固有纤维，是组织打印的理想材料。然而，目前的胶原蛋白-生物墨水表现出较差的可打印性和机械性能。近日，来自中国科学院大学的郑雄飞教授团队进行了高保真度、结构稳定和细胞定向的人造结缔组织3D打印的相关研究。研究成果以“Bioprinting of light-crosslinkable neutral-dissolved collagen to build implantable connective tissue with programmable cellular orientation”为题于2023年04月12日发表在《Biofabrication》上。

图1 光交联中性溶解胶原蛋白生物打印实现打印保真、结构稳定、生物相容性和细胞定向

本文开发了一种可光交联降冰片-胶原蛋白（NorCol），具有完整胶原蛋白结构的NorCol表现出出色的剪切稀化性能和光交联强度，能够实现复杂结构的构建，具有良好的打印保真度和结构稳定性。不同浓度中性溶解的NorCol直接集成到打印具有复合模量的纯胶原蛋白结构中，具有较强生物相容性，模仿细胞外基质（ECM）异质微结构。该复合结构在皮下移植时对宿主组织和毛细血管进行广泛渗透。通过设计印刷丝紧密接口，构建了几何指导和模量无关的各向异性机械环境，实现细胞定向。此外，细胞取向与打印高浓度NorCol方向一致，这与体内细胞和胶原纤维情况相同。NorCol的这种能力为打印基于纯ECM蛋白的、可植入的和功能性的构造物开辟了新天地，适用于人类应用的结缔组织工程。

图2 NorCol具有完整的胶原蛋白分子结构，表现出强剪切稀化性能、光交联强度、可打印性和打印保真度

预水凝胶的剪切稀化特性使其很容易从喷嘴中喷出不会发生物理堵塞，预水凝胶的自愈特性使其在挤出后保持连续的丝状，并在沉积后保持其形状，形成一个具有高保真度的整体结构。HiNorCol的粘度显示随着浓度的增加，粘度迅速增加。由于剪切率的增加，所有浓度都观察到剪切变薄的现象。流变学研究证实NorCol溶液的自愈特性。应用高剪切应变（400%）导致NorCol溶液被完全破坏，使溶液变成了弹性下降（G′）的液体状态。这种自我修复的行为可能是由于胶原蛋白分子之间的非共价相互作用的快速和可逆的重建。HiNorCol更接近于固体水凝胶，在静态状态下表现出形状保持性能。在剪切力作用下，NorCol迅速转变为液体特性，并在剪切力消除后迅速恢复为固体特性。这些可调整的机械性能，与3D打印的分散和积累过程完全匹配。NorCol光交联的机械性能显示对于不同浓度的低度和高度的NorCol（1 w/v%、3 w/v%和5 w/v%），在紫外光照射下，凝胶化转变迅速发生。NorCol中的光敏基团的程度较低，大分子只需要少量的交联点来形成更紧密的网络就可达到满意的剪切模量。

图3 打印脂肪组织的细胞活力、增殖和分化

接下来打印了直径为10毫米、高度为5毫米（32层）的脂肪组织，以验证细胞的活力和分化能力。HiNorCol具有良好的结构强度，可以支持大体积组织的形成和连续培养，但其高粘度和密集的交联网络不适合作为细胞填充材料。使用HiNorCol和LoNorCol的混合打印来实现脂肪组织的结构稳定性和细胞兼容性。脂肪生成或血管形成都需要紧密组织之间的营养交换。本研究使用LoNorCol与3% w/v的明胶作为细胞填充材料。打印头的温度控制在18度，打印底板的温度控制在10度。结果显示加入明胶的LoNorCol形成一个丝状结构，整个结构有明显的孔隙。培养21天后，打印的结构仍然保持整体完整和精细的结构。Bodipy染色是一种亲脂性亮绿色染色剂，可以对非极性脂质进行染色，对细胞内脂质的染色很敏感。结果显示染色细胞分布在LoNorCol的内部，而HiNorCol的表面只分布有少量的脂质滴。进一步证明，与支架表面相比，LoNorCol中的脂肪生成分化表现出数量和稳定性的优势。为了评估打印BMSCs的分化，还分析了组织特异性基因的表达。与基本培养基相比，当BMSCs在成脂培养基中培养时，观察到成脂主调控因子PPARγ的表达明显增加，同时早期成脂标志物LPL也有增加，结合油红O和Bodipy的染色结果，细胞分化为脂肪组织的趋势是明显的。

图4 诱导细胞取向的打印结构几何设计

皮肤和肌腱分别是不规则致密结缔组织和规则致密结缔组织。在皮肤组织中，胶原纤维形成高阶网络，构成主要的真皮结构，负责多方向的拉力，肌腱在胶原纤维结构中带有更多的定向模式，在肌肉收缩时传递和承受单向的张力。建立定向的细胞结构对结缔组织的体外重塑具有重要意义。本研究将HiNorCol和LoNorCol在同一方向上交替打印，限制LoNorCol在打印方向上的收缩。HiNorCol的较高硬度将通过粘附界面传递给含有细胞的LoNorCol。细胞遵循硬度梯度的趋势，是细胞定向的根本原因。细胞内的分子马达，如肌球蛋白II，通过刚性的肌动蛋白丝束和顺应性的跨膜分子离合器，如整合素，将力传递给ECM。单一的马达-离合器引起不同的变形，成为柔软或坚硬的基质，导致牵引力和F-actin的逆向流速的差异，反过来又影响了细胞行为。该结果表明当一个细胞在前部和后部对基质施加相等的力时，不同程度变形了僵硬程度分级的ECM，在软边缘比僵硬边缘变形更多，从而导致细胞中心向基质较硬区域转移。在三维环境中，基质硬度的增加也会增加内皮细胞的萌发和生长。

图5 打印肌腱结构的特点

研究人员打印了不同的肌腱结构，以揭示肌腱厚度和长丝大小对细胞取向的影响。增加厚度的肌腱结构被称为加厚的肌腱。用两根锥形HiNorCol丝来增加硬段比例的肌腱结构被称为双HiNorCol丝。在培养7天后，所有组别都显示出明显的细胞定向。统计学结果也显示所有组别都有较高的细胞定向，三组之间没有明显的差异。根据上文的假设，增加硬块的比例不会减少肌腱结构垂直方向上的刚度差异。不同厚度的肌腱显示出相似的细胞方向，证明Z方向结构的变化对xy平面的影响很小，进一步证明将三维凝胶简化为二维是可行的。晚期约束的方法对引导细胞取向具有广泛的适应性。接着还观察了细胞向HiNorCol迁移的过程。第7天，细胞开始爬到HiNorCol的表面。14天时，NiNorCol被细胞完全覆盖。

本文开发了一种新的基于胶原蛋白混合打印系统，具有高打印保真度、结构稳定性、生物相容性和细胞活性，适用于结缔组织重建。基于完整的胶原蛋白分子结构，NorCol随着浓度的增加显示出优异的挤出性能和可调节的机械强度，使得HiNorCol能够打印出复杂、精致和稳定的结构。体内植入结果证实，结构稳定性对于软水凝胶在原位保持不流失，加速组织和血管向打印结构内的浸润至关重要。结合LoNorCol，打印了大量的脂肪组织，其中BMSCs分化为脂肪生成细胞。依靠NorCol紧密结合界面，构建了一个由几何结构引导的、与模量无关的差异性三维刚度环境，并实现了细胞定向以重塑肌腱和皮肤组织。本研究设计的NorCol打印系统证明是解决结缔组织建设中分子、细胞和组织层面多尺度力学要求的一种有前途的方法。应该加速纯胶原蛋白作为组织工程和再生医学重要生物材料的应用，并提高研究人员对组织打印中细胞机械微环境的关注。

文章来源：https://iopscience.iop.org/article/10.1088/1758-5090/acc760