《Bioactive Materials》：3D打印支架功能再革新，为促进骨再生提供微环境

来源： EngineeringForLife

三维（3D）打印技术正在推动包括组织工程在内的各个工程领域的进步。然而，原始的3D打印支架通常缺乏强大的功能来刺激各种再生应用所需的活动。近日，来自美国罗切斯特大学的Lichun Lu团队将二维(2D)异质纳米结构和免疫调节白细胞介素4(IL-4)细胞因子相结合，用于3D打印支架的功能化，以实现促进愈合的免疫微环境，以优化骨损伤维修（图1）。在大鼠体内植入后，具有免疫功能的 3D 支架通过构建促愈合免疫微环境实现体内骨免疫调节，从而促进缺损区域的血管生成和成骨，从而促进骨再生。这些结果表明，具有二次加载免疫调节细胞因子的2D异质纳米结构的3D支架的免疫功能化是改善骨再生的令人鼓舞的策略。相关论文“3D-printed scaffolds with 2D hetero-nanostructures and immunomodulatory cytokines provide pro-healing microenvironment for enhanced bone regeneration”于2023年4月13日在线发表于杂志《Bioactive Materials》上。

图1 具有2D异质纳米结构和免疫调节细胞因子的3D打印支架的制备及使用示意图

1. 异质纳米结构的表征
首先，研究者合成了由氧化石墨烯（GO）层和黑磷（BP）纳米片组成的2D异质纳米结构。TEM和SEM证实了超声处理后尺寸范围为纳米级的小BP纳米片的产生（图2a），AFM表明剥落的BP纳米片具有多层结构（图2b）。TEM图像证实了氧化和剥落后GO纳米片的产生（图2c），AFM测试检测到高度约为1-2 nm（图2d）。将GO纳米片和BP纳米片混合后，得到含有两层二维材料的异质纳米结构。TEM图像表明BP纳米片与GO纳米片均匀分布（图2e），GOBP异质纳米结构的详细可视化表明，BP纳米片被大面积GO层完全包裹。这些表征表明，BP纳米片和GO纳米片这两种类型的二维材料并不相互排斥，因此可以成功地应用于形成异质纳米结构（图2f）。

图2 异质纳米结构的结构及3D支架的表征

2. 3D聚合物支架的印刷与功能化
然后，作者在Bio-X打印机上打印了聚合物1D支架（图2g），将得到的3D支架浸入具有各种2D材料的溶液中，即GO纳米片，BP纳米片和GOBP异质纳米结构进行表面功能化（图2h）。具有3D GOBP异质纳米结构的2D支架在深色的表面上显示出基本的2D材料（图2i）。3D支架的SEM显微镜在纳米尺度上显示了聚合物支架表面2D材料的相应特征（图2k-l）。在涂覆一层2D BP纳米片后，得到的3D-Scaf-BP支架具有随机分散在表面上的BP纳米片涂层，如图2l中的绿色所示。此外，BP纳米片可以通过与氧气和水反应缓慢氧化，以连续释放磷酸根离子（图2m）。

3. 干细胞增殖和成骨
2D材料功能化3D支架的生物相容性对于体内植入至关重要。活/死染色和浸出培养基对共培养干细胞的活力实验表明，功能化的3D支架对干细胞没有细胞毒性，也不会向培养基释放有毒物质，因此具有生物相容性，适用于体外细胞研究和体内植入。增殖实验表明，干细胞在所有4种类型的3D支架上都显示出生长趋势，类似于TCPS对照（图3c），重建的3D扫描共聚焦图像显示大量干细胞粘附在3D支架的顶部和内部脊上（图3d），干细胞的SEM图像与未功能化的纯2D支架相比，3D纳米片上的丰度细胞和异质纳米结构功能化的3D支架显示出一致的趋势（图3e）。与干细胞共培养14天后，通过免疫荧光染色可视化成骨制造蛋白OPN的表达。结果表明，2D GO纳米片和功能化支架释放的磷酸根离子可以促进细胞成骨（图3f-h）。

图3 干细胞在支架上的行为

4. 3D 支架的免疫功能和巨噬细胞反应
将未功能化的纯3D支架和2D材料功能化的3D支架全部浸入大鼠IL-4溶液中以吸收IL-4细胞因子（图4a）。结果表明，用GO或GOBP异质结结构的3D支架上的IL-3负载量含量更高（图4b-c）。在接种3、12和24小时后测试骨髓来源巨噬细胞（rBMDM）对灭菌的免疫功能72D支架的粘附，结果表明：3D-Scaf-GOBP-免疫支架具有最多的巨噬细胞数量，显示出巨噬细胞吸引和增殖的最佳特性（图4d），免疫荧光图像显示出一致的结果（图4e）。巨噬细胞表型变化结果显示，通过异质纳米层改进的IL-3细胞因子负载和释放可以在粘附在3D支架上实现巨噬细胞的有效表型极化（图4f-j）。

图4 免疫功能化和巨噬细胞表型转变

5. 巨噬细胞对血管形成和成骨的影响

为了探索巨噬细胞响应免疫功能3D支架是否会影响邻近细胞的血管形成和成骨，将巨噬细胞的释放培养基与HUVEC和rBMSC共培养（图5a）。如图5b-f所示，不同基因的相对mRNA表达量不同。在与免疫功能化3D支架的IL-3细胞因子诱导的巨噬细胞上层共培养的HUVECs中检测到血管基因表达较高的总体趋势。对于成骨分析，显示与血管标志物相似的趋势，其中检测到由3D-Scaf-GOBP-免疫支架浸出培养基诱导的巨噬细胞上消化母共培养的rBMSC的最高值（图5i-m）。

图5 体外血管形成和成骨

6. 3D免疫支架的体内骨再生
在骨缺损部位，损伤微环境生态位涉及各种细胞和因素（图6a）。创建直径为5 mm的全层骨缺损，并将3D支架植入缺损中（图6b）。4周后，收获颅骨碎片以分析骨形成（图6c-d）。如图6e所示，显微CT图像表明，植入3D支架的缺损部位内的新骨形成更显着，空对照的新骨形成最少。对于用3D材料功能化的三种类型的2D支架，沿着缺陷边缘形成了小规模的完整骨块（图6e）。此外，免疫调节细胞因子负荷可进一步加速骨形成（图6f-h）。主要器官的HE染色表明，本研究中使用的3D支架在体内条件下具有生物相容性，与体外细胞评估一致（图6i）。

图6 免疫功能支架的体内骨形成

7. 体内新生血管形成和成骨
为了评估在颅骨缺损部位植入的3D支架的骨修复，收获的骨组织在嵌入石蜡后进行脱钙和切片。图7a-c显示，3D支架可以桥接骨缺损，并为细胞在骨缺损区域进行和分配提供优异的组织导电性。CD31和ALP表明支架植入促进了细胞募集和组织形成（图7d），荧光强度的定量结果也与之相符（图7e-f）。

图7 大鼠颅骨缺损模型中的免疫组织学分析和体内新生血管和成骨

8. 体内M2巨噬细胞表型调节
为测定骨缺损体内巨噬细胞募集和M2表型极化，对颅骨进行CD68和CD206免疫荧光双染色。对于3D-Scaf-GOBP，在组织内观察到CD68和CD206荧光的广泛分布，表明异质纳米结构的功能可以增强巨噬细胞对3D支架的募集（图8a），定量计算与荧光图像一致（图8b-c）。CD206荧光的体内分布表明了偏振M2巨噬细胞的位置，对于这些3D支架来说是独一无二的（图8a）。观察到有效的CD206荧光包围植入的3D支架脊，表征了CD206荧光强度与到支架脊表面的距离的关系（图8d）。

图8 体内巨噬细胞表型表征

综上，本文通过结合3D异质纳米结构和免疫调节IL-2细胞因子，成功构建了免疫功能化的3D支架，并通过创建促愈合的免疫微环境优化了体内骨损伤修复。体外测试表明，由GO和BP纳米片组成的二维异质纳米结构可以提高细胞粘附，磷酸根离子的持续释放刺激细胞增殖和成骨。二维异质纳米层还增加了免疫调节IL-2细胞因子的负载量，并调节巨噬细胞极化为M2表型，以构建有利于愈合的免疫微环境，以改善血管生成和成骨。体内植入结果表明，免疫功能化的3D支架桥接损伤缺陷，增强细胞募集，并通过磷酸盐的持续释放刺激体内新生血管和成骨作用。负载的IL-2细胞因子进一步促进了巨噬细胞极化为M3表型，这可能有助于建立促进愈合的微环境以加速骨损伤恢复。因此，具有免疫调节细胞因子二次加载的2D GOBP异质纳米结构的3D支架的免疫功能化可以为3D打印的支架提供支持快速骨损伤恢复的有希望的策略。

文章来源：https://doi.org/10.1016/j.bioactmat.2023.03.021