生物3D打印构建的仿生多层植入物有效促进皮肤伤口愈合

来源： EngineeringForLife

皮肤被认为是抵御外部物理、化学和微生物攻击的主要屏障。创伤、感染、烧伤和糖尿病是全层皮肤缺损的常见原因，修复此类缺损是一项重大的临床挑战。自体或同种异体皮肤移植是应对这一挑战的理想选择，但仍存在供体不足和免疫排斥反应问题。

活细胞和生物材料的生物3D打印是解决这一挑战的一项有前景的技术。然而，生物材料的制备耗时且来源有限是必须解决的瓶颈。针对此问题，来自解放军总医院第四医学中心烧伤整形医学部的陈敏亮医师开发了一种简单快速的方法，将脂肪组织直接加工成微碎片脂肪细胞外基质（mFAECM）作为生物墨水的主要成分，以制造生物打印的仿生多层植入物。通过mFAECM复合生物墨水和细胞制造的仿生多层植入物可以通过促进伤口内新组织的收缩、胶原蛋白分泌和重塑以及新血管形成来加速伤口愈合。

相关研究成果以“3D-Bioprinted Biomimetic Multilayer Implants Comprising Microfragmented Adipose Extracellular Matrix and Cells Improve Wound Healing in a Murine Model of Full-Thickness Skin Defects”为题于2023年6月14日发表在《ACS Appl. Mater. Interfaces》上。

图1 仿生多层植入物的3D打印、制造和植入示意图

1. mFAECM的制备和表征

作者首先收集了均质化的ECM，其具有均匀致密的絮状外观（图2A）。在本研究中，使用三通连接器两次均质化ECM，通过改变三通阀角度以减小孔径来进一步破碎ECM。为了能够立即使用该材料，该研究没有使用需要数十个小时才能完成的无细胞方法，因此ECM中发现了一些细胞核（图2B）。作为一种可立即使用的自体材料，少量细胞的存在不会影响实用性。对mFAECM和天然组织关键成分的分析表明天然组织的大部分胶原蛋白和sGAG含量保留在mFAECM中。

图2 mFAECM 的制备和表征

2. 流变及其结构特性

当温度低于22 ℃时，储能模量和损耗模量的变化幅度突然增大。储能模量在约19.8 °C时超过损耗模量，表明从液体转变为凝胶。与此同时，损耗角正切突然下降，也反映了从液体到固体的转变（图3A）。因此，作者选择19−21 ℃作为打印温度。在 0−30 °C范围内，生物墨水粘度随着温度升高而降低（图3B）。作者还在17和20 °C下通过稳定剪切扫描分析了粘度，发现在两个温度下粘度随着剪切速率的增加而降低，显示出剪切稀化特性（图3C）。SEM结果显示复合生物墨水的多孔微观结构，孔径范围为50至200μm，足以允许内皮细胞迁移和血管生成（图3D）。

图3 mFAECM-GelMA-HAMA 复合生物墨水的流变学和微观结构特性

3. 仿生多层植入物的制造

接着，为了创建可打印的mFAECM，作者将其与甲基丙烯酰明胶(GelMA)和甲基丙烯酰透明质酸(HAMA)结合形成三种生物墨水。为了评估mFAECM复合生物墨水的可打印性，应用3D打印技术来制造圆形、网状四层结构，该构造表现出高保真度，并且与设计模式高度一致（图4A-B）。使用连接到打印机的高清相机拍摄的图像显示，生物墨水轨迹保持连续，并且每条线独立分布，没有合并或折叠（图4C）。SEM图像显示细胞附着在孔上（图4D），例如结构下层的孔。总之，mFAECM复合生物墨水表现出良好的可打印性和保真度，可以支持细胞附着。

图4 仿生多层植入物的制造和微观结构

4. 体外生物相容性
为了评估mFAECM复合生物墨水和光引发剂的生物相容性，将 HaCaT、成纤维细胞和HUVEC分别封装在复合生物墨水中并在单层印刷结构中培养。所有细胞类型从第1天到第7天均增殖（图 5A），并且活力保持 > 90%（图5B）。总DNA含量随着时间的推移而增加，第1、3和7天之间存在显着差异（图5C）。这些结果表明mFAECM复合生物墨水具有良好的生物相容性，并且打印温度和压力不会对细胞活力产生不利影响。

图5 细胞相容性评价

5. 仿生多层植入物促进小鼠模型中的皮肤伤口愈合

为了评估由mFAECM和细胞组成的生物打印仿生多层植入物对体内伤口愈合的效果，作者在裸鼠中制备了全层皮肤缺损模型（图6A）。植入后的第14天，充满细胞的组已实现伤口完全闭合，而无细胞组仍有一小片未愈合的伤口，空白组未愈合伤口较大（图6A-D）。形态学分析表明，生物打印仿生多层植入物的伤口愈合效果最好。

H&E染色用于评估愈合伤口区域的整体组成和解剖结构。第14天的染色结果表明充满细胞和无细胞组的表皮结构更加完整。与脱细胞组相比，细胞负载组的真皮结构分布更加均匀，血管和纤维组织清晰可见（图6E）。

图6 动物皮肤伤口模型及HE染色分析

综上，本文描述了一种快速而简单的方法来直接处理脂肪组织以获得mFAECM，它将用作生物墨水的主要成分来制造生物3D打印的充满细胞的仿生多层植入物。结果表明，mFAECM 复合生物墨水具有良好的生物相容性、可打印性和保真度，并且可以支持细胞粘附。植入物中封装的细胞在植入后可以正常存活并参与伤口修复。植入物的基本结构在整个伤口愈合过程中得到维持，并在后期逐渐代谢。这项研究为改善生物3D打印皮肤替代品的及时制造提供了一条有效的途径，这对于大规模全层皮肤缺损至关重要。

文章来源：https://doi.org/10.1021/acsami.2c21629