浙江大学贺永教授等：周围神经再生和脊髓损伤修复3D打印支架研究进展

来源：极端制造 IJEM
作者：Editorial Office

复杂的神经解剖结构导致长距离周围神经再生和脊髓损伤修复一直是一个巨大挑战。生物支架通过支架结构和种子细胞提供仿生天然组织的结构和功能，可加速神经再生过程，而3D打印技术的迅猛发展使研究人员能够开发具有复杂结构和功能多样的新型3D支架，实现结构和功能的高度仿生。

近期，浙江大学机械学院贺永教授、东莞理工学院特聘副教授宋菊青等人在SCI核心期刊《极端制造》（International Journal of Extreme Manufacturing, IJEM）上发表了题为《Advances in 3D printing scaffolds for peripheral nerve and spinal cord injury repair》的综述。论文概述了周围神经和脊髓的解剖结构，以及目前临床上周围神经损伤（PNI）和脊髓损伤（SCI）的治疗策略。然后讨论了周围神经和脊髓组织工程的设计要素，并详述了适用于神经组织工程的多种3D打印技术。最后重点介绍了3D打印技术在周围神经再生和脊髓修复中的应用，包括诱导神经分化、制造神经引导导管、建立脊髓神经网络和构建脊髓样支架（如图1），以及该研究领域的挑战和前景。

亮点
系统概述了神经系统的解剖结构、神经损伤的当前治疗策略以及神经损伤修复支架的设计要素。
探讨了挤出打印、立体光固化和面投影打印等3D打印工艺如何有效的构建神经损伤修复支架。
归纳总结了3D打印支架在周围神经再生和脊髓损伤修复中的最新应用，可以为组织工程神经修复和再生提供新的思路。

图1 神经支架的设计要素、适用的3D打印技术和典型应用

研究背景
神经系统损伤可能导致神经横断和血神经屏障破坏，最终导致疼痛、感觉障碍和身心损伤。神经横断会导致神经元与其支持细胞之间的通讯中断。所有这些损伤都可能发生在中枢神经系统（CNS）和周围神经系统（PNS）中，而它们的神经元对轴突横断的响应在其根本上是不同的。PNS在损伤后具有先天性再生潜力，但对于间隙长度大于10 mm的缺陷，神经再生不会自发发生。目前，修复长间隙周围神经损伤（PNI）的临床标准是使用自体移植物。然而，仍存在一些局限性，如供体来源短缺、大小不匹配和对供体部位的永久性损伤等。与PNS不同，CNS中横断的轴突只能产生功能不足的发芽，而这几乎不能提供功能恢复。目前，通过药物治疗和康复训练进行姑息性功能恢复是首选。然而，这些方法既不能逆转神经损伤，也不能恢复运动能力。组织工程技术旨在使用工程方法（包括支架、细胞以及生物物理和生物化学信号）来替换、修复或再生受损、退化或有缺陷的组织，并在周围神经和脊髓再生方面显示出潜在的优势。而3D打印技术能够为设计和制造组织工程支架提供所需的空间精度，可以模拟组织结构和材料灵活性，以匹配天然组织的机械和化学特性。3D打印技术使用可固化的材料和计算机控制的工作系统，在设定的数字模型指导下，逐层构建3D结构，可以很容易地获得包含生物材料、多种细胞和/或生长因子的精细几何分布，并可以提供个性化的患者特异性治疗选择。本文对适用于神经组织工程的3D打印技术及其典型应用进行了详细的介绍和总结。

最新进展
3.1. 适用于神经组织工程支架的3D打印技术
3D打印是一系列灵活的增材制造技术，可以精确地构建具有复杂3D特征的结构。它在设计灵活性、个性化定制、结构可靠性和适用材料的多样性方面具有很大的优势。作者总结了神经组织工程中广泛使用的3D打印方法，包括喷墨打印、挤出打印、立体光固化、面投影技术和一些新兴的3D打印技术。

喷墨打印能够以高度可控的方式沿着 x、 y 和 z 轴沉积微小的聚合物溶液液滴，层层累积后在基板上生成所需图案。在成型过程中，墨水材料必须保持液态，以便能够形成液滴并在沉积后立即凝固，从而形成一个3D 结构的支架。喷墨打印技术结合了数据驱动和非接触方法，能够使精确体积的墨水以高速和准确的方式沉积在目标位置。目前有多种类型的喷墨打印，如基于热能机制、压电机制等（图2a）。用于生物打印的喷墨技术已经成功地打印了液体生物墨水，在微米尺度分辨率下，可以同时沉积不同类型的材料和细胞并精准定位。喷墨生物打印在打印分辨率上具有一定的优势，已有研究表明，按需喷墨打印可以用来精确地沉积细胞而不牺牲其活力，对细胞的精确定位可以促进精细神经网络的建立。喷墨打印技术的主要问题是细胞或材料可能会堵塞打印头的喷嘴，这可能会产生热应力、机械应力等，从而损伤细胞。为了防止喷嘴堵塞，墨水必须具备低粘度和低细胞密度。这些条件的控制反过来又导致打印过程中的其他限制（如液滴扩散、细胞沉淀等)。

挤出打印是在计算机控制下，通过可移动打印头上的喷嘴逐层沉积材料实现的（图2b)。它分为基于熔融和基于溶液两种打印方法。挤出打印技术是应用最广泛的构建载细胞的3D结构的技术之一，它使用活塞或螺杆不断挤出生物墨水。挤压产生的压力和剪切力是造成细胞损伤的主要原因，因此需要对打印参数（细胞密度、生物墨水粘度、温度、气压等）进行优化，以防止细胞凋亡。这种生物打印方法的最大优点是可以打印细胞密度较高的粘性生物墨水，这是其他打印技术不易达到的。另一方面，与其他打印方法相比，挤出生物打印的分辨率稍差，对打印形状和固定细胞位点的精确预置能力较低。常用的基础打印工艺主要包括熔融沉积成型（FDM）、墨水直写和近场直写（MEW）。

图2（a）喷墨打印和（b）挤出打印的示意图。经许可转载，版权所有Elsevier Ltd。

光固化技术（SLA）是基于液体光敏树脂的光聚合原理的工艺，即在紫外或者其他光源照射下液态光敏树脂发生光聚合反应从而固化。当计算机控制的激光束在偏转镜的作用下扫描到树脂液体表面时，光斑经过的区域液体从点到面凝固。当第一层扫描完成后，升降机驱动平台下降一层高度，然后扫描下一层，直到得到一个完整的3D实体。因此，SLA是一个相对缓慢的打印过程（图3a）。使用SLA技术可以构建具有明确定义的微观结构和互连孔隙的组织工程支架。与基于喷墨和挤出的打印相比，SLA不存在喷嘴堵塞的问题，因此扩大了生物墨水粘度和细胞密度的范围。但细胞活力将受到SLA工艺要求的显著影响，即生物墨水须与光源兼容。此外，在SLA工艺中，用于交联水凝胶的掺入光引发剂引起的材料毒性也是该技术在生物打印中应用的主要挑战之一。因此需要对生物相容性打印墨水进行更多的研究，以提高SLA在临床相关神经组织工程结构中的应用。

面投影技术（DLP）也是基于树脂材料的光聚合反应，不同于SLA的自下而上，DLP是一种自上而下的方法。DLP和SLA工艺的主要区别在于SLA可以投射激光束的光斑，而在DLP系统中由数百万面镜子组成的数字微镜装置（DMD）可以直接将二维的平面图像投射到光敏材料的平面，从而大大提高了打印效率（图3b）。尽管DLP有很多的优势，但是适用于神经组织工程的打印材料还有待开发。

图3（a）立体光固化和（b）面投影技术的示意图。经许可转载，版权所有(2012) Elsevier Ltd。

3.2. 3D打印在周围神经和脊髓损伤修复中的应用
3D打印功能性支架诱导神经分化
在使用3D打印技术构建神经支架的过程中，可以预先设计打印墨水的物理和生物化学性质以及形成的支架结构，以获得可以引导神经分化的功能性支架。考虑到神经组织的电生理特性，许多研究使用3D打印技术来制备导电支架。图4总结了多种用于诱导神经分化的3D打印功能性支架的方法和效果。

图4（a–c）用于培养PC12细胞的导电PPy/胶原基底示意图，以及喷墨打印的PPy直线和在导电支架上生长的PC12细胞的图像。经许可转载，版权所有(2012) Elsevier B.V。（d–f）用于引导神经细胞定向生长的3D打印功能化纳米复合材料示意图，以及分别在纯PCL膜和CNF基复合材料上培养的神经细胞行为的图像。经许可转载，版权所有Royal Society of Chemistry。（g–j）3D导电神经支架的示意图，以及电刺激作用下3D打印支架中DRG细胞的行为和功能。经许可转载，版权所有(2019) Elsevier B.V。（k–m）光刺激响应的3D打印支架示意图，以及支架多孔结构和NSCs在有/无光刺激作用下第14天的神经元分化图像。经许可转载，版权所有(2017) IOP Publishing Ltd。

3D打印神经引导导管用于周围神经修复
大量研究证明，神经引导导管（NGCs）作为一种组织工程植入物，在PNI修复中具有广阔的应用前景。然而，现有的NGCs存在许多挑战，如复杂的制造过程、简单的体系结构以及缺乏有效的指导信号。作为一种快速成型技术，3D打印可以轻松快速地构建所需的结构，以模拟神经组织的宏观和微观结构。作者总结了四类促进周围神经修复和再生的3D打印NGCs，包括能够改善微环境的各向异性NGCs、增强神经再生的药物递送NGCs、加速临床应用的个性化NGCs和辅助神经缝合术的特殊设计NGCs。图5和图6分别总结了3D打印制造各向异性NGCs和个性化NGCs的方法和效果。

图5（a–e）模拟PNI微环境的3D打印多尺度NGC的示意图，仿生支架及NGC的结构，以及外周神经再生的体外和体内研究结果。经许可转载，版权所有(2021) Wiley-VCH GmbH。（f–m）用可见光催化的功能化3D生物活性NGC的示意图，3D打印支架和NGC的各向异性结构，以及对PC12细胞行为的指导作用。经许可转载，版权所有(2020) Elsevier Ltd。

图6（a–f）DLP打印的具有多通道结构的NGCs以及对NCSCs分化和功能的影响。经许可转载，版权所有(2020) Elsevier Ltd。（g–m）个性化定制的3D打印NGCs以及坐骨神经损伤的体内研究。经许可转载，版权所有(2018) Elsevier Ltd。

3D打印结构促进脊髓神经网络建立
细胞的精确空间排列对组织的功能性生长至关重要。由于脊髓包含一系列具有各种组织形态的细胞类型，这一点尤为重要。另外，精确的时空形态发生梯度产生特定的基因表达模式并控制神经前体细胞（NPCs）的增殖和分化，是驱动脊髓中具有不同功能的不同细胞群的原因。3D打印技术在构建具有精确空间组织的多细胞神经组织和具有分子浓度梯度的支架方面具有可行性，可以促进脊髓网络的建立。图7总结了3D打印结构促进脊髓神经网络建立的方法和效果。

图7（a–i）负载sNPCs和OPCs的3D打印生物相容性脊髓支架的构建以及用于SCI修复的体外研究。经许可转载，版权所有(2018) WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim。（j–n）3D打印支架的示意图以及脊髓神经网络形成的体外研究。经许可转载，版权所有Wiley-VCH GmbH。

3D打印脊髓样支架用于SCI修复
3D打印为脊髓损伤修复提供了各种可行的解决方案，使用不同的生物墨水材料并结合不同的成分（如细胞、生长因子和生物分子）来促进脊髓再生。可以打印由生物材料、活细胞和/或生物活性因子组成的生物墨水，通过精确调节生物墨水中各成分的比例和打印条件，可以更好地模拟组织或器官的生理结构、机械性能和生物功能，最终实现损伤组织/器官的精确制造和快速修复。图8总结了3D生物打印支架改善干细胞治疗并促进SCI修复的方法和效果。

图8（a–f）负载NSCs的生物打印脊髓样支架的示意图，以及植入12周后SCI修复的体内研究。（d）中的GFP（绿色）和Tuj1（红色）、（e）中的GFP（绿色）和NF（红色）以及（f）中的GFP（绿色）和Oligo2（红色）的免疫染色分别显示了病变区域中植入的神经干细胞的存活和神经分化、成熟神经元的形成以及少突胶质细胞的分化。经许可转载，版权所有(2021) Elsevier Ltd。（g–m）负载NSCs和OSMI-4的3D打印SM水凝胶支架（SM-OSMI-4 + NSCs）的示意图，以及SCI修复的体外和体内研究结果。（j）中的活/死染色显示培养7天后，3D生物打印支架中NSCs的存活情况。（k）中的GFAP（绿色）和Tuj1（红色）、（l）中的NF（红色）和（m）中的GAP43（红色）的免疫荧光染色显示了植入两个月后SM-OSMI-4 + NSCs组病变区域的神经丝再生和轴突再生情况。经许可转载，版权所有(2022) Elsevier Ltd。

未来展望
3D打印技术的快速发展和持续创新打破了传统技术在制造先进神经组织工程支架方面的局限性，可以构建复杂的神经支架。然而，未来仍面临一些挑战：
（1）天然周围神经具有多尺度的层次结构，3D打印支架有望准确模拟周围神经的结构。但大多数基于挤出的3D打印支架只能在低水平上模拟分层结构，并且打印分辨率有限。因此，应该开发更复杂的微挤压喷嘴，以实现具有更高分辨率的神经支架的制造，甚至实现多尺度3D打印；
（2）神经元的细胞体和轴突分别组成天然脊髓的灰质和白质，呈现出具有多种功能的异质结构。然而，具有各种功能的集成的脊髓支架很难制造。因此，应采用优化的3D打印策略来构建具有复杂特征的定制支架，以实现多组分3D打印；
（3）在长距离PNI中，由于缺乏足够的生化信号引导，即使引入了NGCs，受伤的神经也很难跨越鸿沟再生。因此，应该开发更卓越的3D打印技术，通过在打印过程中原位结合所需的生物化学信号来“缩短”神经损伤的距离；
（4）有效的电信号传导对神经再生至关重要，但目前3D打印支架中使用的导电/压电材料是不可降解的。因此，有必要开发新型的、生物相容的可打印材料；
（5）提供具有足够血管化的支架以便在神经再生过程中输送足够的氧气和营养物质是至关重要的，但很少有支架是专门制造用以实现具有必要血管化的神经再生。因此，为了构建神经再生增强和血管生成增强的支架，需要适当的策略，例如血管生长因子的控制释放和支架中血管样通道的建立。图9总结了3D打印神经支架的挑战与前景。

图9 3D打印神经支架的挑战与前景。