【文献分享】基于黄原胶浴悬浮3D打印致密复杂组织

来源： 生物打印与再生工程

三维(3D)生物打印越来越多应用于组装与生物组织的组成、结构和功能类似的结构。在使用高密度细胞时，细胞可以在无支架环境中组装成复杂的生理组织结构。但是普通的打印方式无法平衡细胞密度与剪应力值的关系，导致要么因为高细胞浓度产生的高应力值对于细胞造成危害；要么因为低细胞浓度无法进行自组装过程。并且3D生物打印中一般添加额外的材料，如水凝胶，以限制剪切应力，并提高形状保真度和分辨率。但是水凝胶油墨中可以加入的最大细胞浓度明显低于同等组织中的浓度。此外，水凝胶成分经常干扰细胞的自组装过程。

为了规避这些限制，特温特大学（UT）应用干细胞系的Robert Passier教授团队提出了一种简单而廉价的嵌入式打印方法，基于黄原胶浴，使用由细胞、球体、水凝胶珠或其组合组成的稀释颗粒悬浮液来3D打印致密的功能性线性组织。利用这种方法，Robert Passier团队证明了功能性心脏组织纤维（心外膜细胞层围绕着心肌细胞体）的自组织过程。

背景介绍
随着开创性的研究成果展示了在散装流体和颗粒介质中的嵌入式打印的优越性，引发了3D生物打印的范式转变。嵌入式打印允许3D打印低粘度生物墨水，同时高浓度细胞悬浮液的打印在碳球颗粒浴中显示出非常高的保真度和形状控制。尽管已报道的嵌入式打印方法已经清楚地展示了该技术的潜力，但大多数刊物中要么使用具有非常高细胞密度的油墨，导致细胞暴露于高剪切应力值，要么导致具有低细胞密度的打印结构，这可能阻碍自组装成致密的组织结构。在少数只使用细胞墨水的嵌入打印案例中，要么是周围的嵌入液对细胞活力产生负面影响，要么是细胞与周围环境混合并相互作用。在Brassard等人报道的唯一案例中，高细胞活力和挤压细胞悬浮液导致自组装，需要复杂的包埋浴配方和定制的挤压设备。此外，尽管目前的数据表明细胞在打印后被包装，但这一过程并未被描述。

本文提出了一种将稀释水悬浮液生物打印成致密显微组织的方法：在屈服应力流体浴中打印液滴和线条, 从而最大限度地减少了挤出所需的压力和油墨内产生的剪切应力。油墨在黄原胶包埋液中打印(图1(B))，之后液体从打印结构中径向扩散(图1(C))。这导致悬浮液的液体体积分数急剧下降，从而将颗粒集中在绘制的轨迹位置。Robert Passier团队证明，这将导致复杂的微组织纤维的自组装，并且打印出的微组织纤维仅由生物链接的颗粒部分组成(图1(C)和(D))。

相对于Nelson等人的工作，本文关键的技术调整是，本研究中使用的悬浮液由与嵌入液相混溶的液体组成。此外，生物墨水描绘了水溶液的粘度，从而最大限度地减少了挤出所需的压力和墨水内产生的剪切应力。此外，这种方法与多种球形实体兼容，包括细胞、细胞球状体和水凝胶微珠，这有可能包括对发育组织中的受控化学或机械刺激。

图1 打印过程

实验结果与讨论

一、打印参数优化

（1）悬浮油墨密度调节

为了实现一致的油墨性能并允许相关的打印时间，在油墨中加入了密度调节剂(碘沙醇)，以保持悬浮液的均匀分布。当颗粒与介质的密度匹配可以延长悬浮油墨的操作窗口，因为它可以防止沉降或漂浮，同时保证颗粒在液相中的均匀分散。（图2(A)颗粒悬浮液）同时当颗粒以低体积分数(ϕp < 0.1)均匀分散在密度匹配的液相中时，颗粒不会感受到彼此的局部扰动流场，颗粒也不会显著改变液体的流变特性。

（2）打印方向探索

通过不同的打印方向可以得到不同的结构。将喷嘴水平移动通过黄原胶浴导致形成临时沟槽，该沟槽在喷嘴通过后瞬间充满黄原胶。被挤出的材料倾向于沿着喷嘴外侧流过沟槽，形成片状结构。(图2(B (i))) 而当标准喷嘴在浴槽中垂直移动时，导致沿喷嘴路径打印出一条竖线。(图2(B (ii))同时为了防止在水平位移的情况下喷嘴周围的墨水流动，使用了90°弯曲的针打印。(图2(B (iii)))

（3）扩散堆积现象

通过用染料标记油墨的液相，可以看出液相在挤出后扩散到黄原浴中，形成沿挤出路径的浓缩颗粒物质直线（图2（C（i-ii）））。

（4）生物相容性

为了证明该方法的生物相容性，使用直径约为60 μm的SMC微球在0.1 φp用作悬浮油墨的颗粒部分，将打印品系培养7 d，得到完全融合和致密的组织纤维（图2（D（i-iii）））。

图2 牛顿流体和稀释悬浮液的嵌入式 3D 打印

二、扩散堆积的机制

（1）定制成像装置

Robert Passier团队准备了一个定制的成像装置，允许在打印时对多个组分进行实时多色荧光成像(图3 (A)和(B))。

（2）黄原胶浴与牛顿流体浴打印比较

使用这套成像装置，可以确认当使用黄原胶浴时，挤出的材料沿着喷嘴的外部流动(图3(B))。为了防止这种现象，将黄原胶浴加入2% 海藻酸盐，使其表现为牛顿流体。通过对槽的这种调整，不再发生回流(图3(B))。然而，虽然在黄原胶海藻酸盐液中仍然可以打印悬浮液，但扩散堆积过程不再发生，而是颗粒与包埋液的近端区域混合。这表明黄原胶的剪切变薄和自愈特性对于颗粒结构的形成至关重要。

（3）静态与移动喷嘴以不同注入量打印比较

在1.5%黄原胶液中，静态(i-iii)和移动(iv-vi)喷嘴注入量为10 μl时，溢流(1 ml )、匹配流量(100 μl )和底流(10 μl )。在溢流的情况下，液体猛烈地破坏包埋槽，无论是移动的还是静态的。当静态时，液体沿着阻力最小的路径沿着喷嘴表面运动，当喷嘴在挤压过程中运动时，悬浮液堆积喷嘴体积打开的空腔。

（4）随时间扩散堆积成像

为了确定油墨挤出速率对油墨在黄原胶浴中分布的影响，在保持喷嘴静止的情况下，以三种不同的流速注入0.1 φp的香豆素-6 PS颗粒悬浮液，加入罗丹明B，然后在同时移动喷嘴的情况下重复不同流速的挤出打印(图3(D))。在2ml 的高流速下，液体喷射并推开黄原胶，形成湍流区域。在中间流量为100 μl 时，观察到先前观察到的沿喷嘴回流行为。在10 μl 的低流速下，观察到悬浮液缓慢进入针尖区域。在扩散图中可以观察到轻微倾斜，这与图3(D (v-vi))所示90°弯曲针的轻微角度一致。这进一步证明了流入面积由喷嘴结构决定。

图3 扩散堆积可视化与分析

三、特征打印

为了演示除直线以外的特征的3D打印，使用含有0.1 φp Fe2O3颗粒的墨水打印了大小网格图案(图4(A))。结果表明，特征可以打印重现，并且相交线引起的干扰最小。此外，通过打印一系列具有不同行距的后续线条来探索打印纸张的方法(图4(B))。当后续线的中心间距为400 μm时，可以形成可复制的薄片。较低的300 μm距离会导致颗粒过度堆积，形成不规则的片状物。较高的500 μm距离会导致扩散堆积后的后续线之间出现间隙。

图4 复杂结构打印

四、平台潜力

在本研究中所研究的所有油墨中，悬浮油墨的颗粒最初都是自由地流入喷嘴图区，然后通过扩散堆积进行集中接触，形成致密的颗粒线。海藻酸盐颗粒和胶原颗粒线随着时间的推移是稳定的。CMs、IPSCs和SMC球体随着时间的推移融合形成微组织(图5(B) - (D))。这些组织的形态根据所使用的细胞或细胞球体的融合电位而变化。主要表现为：SMC球体形成了一种刚性纤维，可以用镊子夹起(图2(C))，这一特征也可以在其他配方中观察到，包括iPSCs，以及SMCs与PLA颗粒的组合。在没有细胞的情况下，颗粒保持原位。当分别测试胶原包被颗粒与SMC细胞和SMC球体的组合时，随着时间的推移，观察到复杂组织的自组装。由于组织致密，线条特征转变为多个组织球，以初始细胞和球体浓度最高的区域为中心(图5(E)和(F))。对感兴趣的区域进行z堆叠成像，观察组织结构。这表明，细胞物质包围了颗粒，并将它们整合成一个复合组织。

Robert Passier团队还测试了不同打印喷嘴的使用，与影响打印分辨率的传统参数进行比较，表明使用较小的喷嘴对线条的平均特征分辨率只有边际影响（图5（A））。并且沿其长度改善了线宽的一致性。

五、纤维类器官的自组装

在第3.4节中，观察到细胞物质融合成纤维，这可以被认为是一个自组装过程，Robert Passier团队假设纤维可以随着时间的推移进一步重塑。

（1）荧光蛋白标定

为了验证这一点，Robert Passier团队3D打印了hpsc来源的CMs和hpsc来源的心外膜细胞系，它们都表达不同的荧光蛋白，从而可以跟踪两种细胞类型。hPSC-CMs表达来自NKX2.5基因组位点的GFP，并具有α - actiin - mrubyii融合蛋白。NKX2.5是一种心脏标志物，存在于心脏祖细胞和收缩的CMs中，α -肌动蛋白是CMs中收缩机制的一种肌合成蛋白(图6(A))。通过内源性表达COUP-TFII位点的红色荧光mCherry，可以识别打印构建体中的hpsc -心外膜细胞。COUP-TFII在心外膜细胞中表达，但在心室CMs中不表达(图6(A))。

（2）随时间形成纤维

在图6(B)中，可以观察到心脏/心外膜细胞结构在3 d内形成连接的纤维。第3天之后，纤维延长至第8天，之后纤维缩短。在细胞密度过低的位置，纤维分离成较小的细胞球体。

（3）细胞迁移

如图6(C)所示，根据第0天细胞结构内的荧光分布，打印后细胞立即随机分散。随着时间的推移，细胞逐渐在纤维结构内迁移，在13 d的时间过程中形成双层组织，由一层心外膜细胞覆盖的CMs体组成，类似于人类心脏组织中的组织。

（4）肌节形成

第13天，共聚焦显微镜检查肌节的形成，观察到纤维组织内α -肌动蛋白的均匀分布(图6(D))。

（5）组织自发与起搏跳动

第8天观察到自发性心跳。在心脏纤维电起搏后，组织开始同步跳动，起搏频率可达4hz(图6(E)和(F))。

（6）形成自发附着的组织纤维

当纤维与允许粘附的板表面接触时，观察到组织纤维的自发附着(图6(G))。

图6 心脏组织的生物打印

总结

Robert Passier团队的方法允许简单和廉价的3D打印稀颗粒悬浮液，自组装形成致密复杂的组织纤维。由于不需要水凝胶相，细胞和球体很容易融合并组织成功能结构，如跳动的心脏纤维打印图所示。黄原胶浴可以3D打印具有定义的隔间，以空间定义的模式刺激随后打印的组织。由于镀液的渗透性允许液体扩散，因此可以通过在镀液顶部添加简单的液体来引入趋化引导。如心脏纤维起搏所示，机械和电刺激在培养过程中也是可能的。最后，这种方法是廉价的，可以很容易地适应任何挤出式生物打印机。