《ACS AMI》：使用低粘度生物墨水打印异质3D生物结构

来源： EngineeringForLife

生物打印是一个快速发展的领域，旨在通过特定细胞和生物材料的受控空间沉积来重建复杂的生理微环境用于体内再生和体外建模目的。可以通过合成水凝胶来制造微型结构增强的可调性和先进的生物打印技术，支持在微挤压生物打印中创建复杂的设计。然而，支持全面细胞生物活性（包括细胞粘附、迁移、增殖和分化）的水凝胶是柔软的且表现出较低的形状保真度和机械稳定性。

为了应对这一问题，研究人员开发了融合生物打印。在此方面，来自韩国高等科学技术学院的Je-Kyun Park团队也进行了大量研究，在微结构基底上展示了天然和低粘度水凝胶的高分辨率生物打印。由于其固体基底，该平台仅限于创建单层水凝胶。近日，该团队又引入了一种新的平台，能够制造具有增强分辨率的多层复杂3D结构，以充分利用生物打印的多功能性。用于使用称为3D微网格-生物墨水覆盖结构和互锁培养（3D MOSAIC）平台的混合生物制造方法来生物打印天然和细胞相容性哺乳动物水凝胶（图1）。3D MOSAIC平台能够精确沉积低粘度水凝胶，具有增强的可打印性、分辨率和稳定性，同时保留天然水凝胶的理想特性。

相关研究成果以“Hybrid Biofabrication of Heterogeneous 3D Constructs Using Low-Viscosity Bioinks”为题于2023年8月24日发表在《ACS Appl. Mater. Interfaces》上。

图1 使用3D MOSAIC平台制造低粘度水凝胶3D结构

作者使用商用FDM 3D打印机在微网上打印聚乳酸(PLA)框架，以方便生打印、堆叠和细胞培养过程中的处理。对同一型号的FDM 3D打印机进行修改并与注射泵集成，以创建内部开发的微挤出生物打印机（图1A）。微网格的平纹编织，水平和垂直的金属丝交替地在彼此之上和之下通过，以毛细管钉扎效应支撑打印的水凝胶，并实现高分辨率生物打印（图1B）。微网格仅占据一小部分打印结构（图1C）。然后，可以使用设计用于安装在6孔板中的对准器来对准和堆叠PLA框架的微网格生物墨水层，以形成3D MOSAIC单元（图1D、E）。基于该平台，可以使用天然低粘度水凝胶创建复杂的微型组织生物结构，包括悬垂结构和中空结构（图1F）。

1. 油墨类型、微网格和印刷参数对印刷结构的影响

在微观尺度上，与宏观系统相比，表面与体积之比要高得多，导致表面力（例如表面张力）超过体力（例如重力）。接触角是3D MOSAIC的重要参数，因为它影响生物墨水在微网格上的扩散和粘附。将磷酸盐缓冲盐水(PBS)、聚二甲基硅氧烷 (PDMS)、PDMS与固化剂、纤维蛋白原和明胶以10:1的比例混合的液滴放置在带有金属丝的微网上（图2A、B）。聚合物PDMS和低粘度水凝胶纤维蛋白原和明胶以受控尺寸印刷在微网上（图2C）。

在本研究中，线对线研究了距离和打印流量作为打印生物墨水尺寸的主要影响因素（图2D）。研究了线距在63至508 μm之间的微网格，因为该范围适合高分辨率打印，同时为显微观察提供足够大的开放面积百分比。根据图2B中纤维蛋白原的微网格尺寸和接触角计算在相邻线之间打印水凝胶线的最大流量(Qmax)。当打印在线距为63 μm的微网上时，纤维蛋白原溢出到相邻泳道，因为打印条件不够敏感，无法满足所需的控制（图2E）。

由于缺乏支撑低粘度水凝胶的微结构，在培养皿上打印的纤维蛋白原宽度比在微网上打印的纤维蛋白原宽度大（图2E、F）。纤维蛋白原的宽度由线到线的距离统一，并且可以通过增加打印流量来加宽（图2G）。对于254 μm的线对线距离，纤维蛋白原被打印在微网格的单道上，流速低于计算的Qmax且对于高于其的流速，纤维蛋白原逐道溢出（图2G、H）。通过侧面观察，还可以在低于Qmax 的打印流速下观察到打印水凝胶的高度（图2I）。

因此，基于微网格的生物打印技术产生了具有高分辨率和可控性的结构。微调线距和优化打印参数进一步促进了微网格基底上打印生物墨水的宽度和高度的调节，从而能够制造具有精确尺寸和均匀性的结构。在之后的实验均使用线距为254 μm的微网格，因为该尺寸对于具有适当稳定性和分辨率的生物打印结构来说是实用的。

图2 油墨类型、微网格和印刷参数对印刷结构的影响

2. 利用低打印性的材料制造复杂的均质和异质结构

生物打印可以创建复杂的3D结构，并精确控制空间组织和几何形状。使用从图2获得的微网格和打印参数，作者用可打印性较差的天然水凝胶制造了复杂的均质和异质结构。使用单一类型的彩色纤维蛋白原将线条和晶格打印在线距为254 μm的微网上，以演示低粘度水凝胶的高分辨率打印（图3A、B），还根据图2G、H中的表征数据调整打印流量，以获得双通道格式的相同设计（图3C、D）。水凝胶轮廓和交叉点的精确分辨率和清晰定义证明了基于微网格的生物打印的先进能力，可以使用粘度远低于适合微挤出打印的常规范围的水凝胶创建分隔的微结构。此外，多种类型的生物墨水可以打印在单层微网格上。通过在生物打印机头上安装两个打印喷嘴，彩色明胶和纤维蛋白原依次打印为线条、叉状结构、双螺旋和分支结构（图3F-I）。

图3 使用基于微网格的生物打印使用单一和多种生物墨水打印的单层设计

3. 3D MOSAIC平台打印多层和异构3D结构

为了创建更全面和多尺度的仿生结构，细胞相容性水凝胶内的自发和微观细胞组织可以与微网格上的直接微挤压印刷相结合。通过应用3D MOSAIC平台建立基于微网格的生物打印来制造异质和多层3D结构。三组分结构的肾脏模型被概念化为五层，并使用三种类型的荧光染料分子标记纤维蛋白原进行打印（图4A、B）。打印的纤维蛋白原层在微网上交联，具有高形状保真度和结构完整性（图4C、D）。各个层对齐并堆叠以形成2毫米高的完整3D结构（图4E）。最终的结构由三种天然低粘度水凝胶组成，具有一般的椭圆形结构，具有部分中空的中部和悬垂的脉管系统和输尿管突起（图4F）。通过提供必要的支撑、稳定性和空间控制，微网格促进了在所有三个轴上具有空间自由度的结构的组装。该结构展示了多学科3D MOSAIC平台在创建复杂设计方面的多功能性和潜力，这些设计不受印刷适性下限的限制，并且不会变形和塌陷。

图4 使用3D MOSAIC平台打印多层和异构3D结构

为了评估制造过程对细胞活力的影响，对生物墨水混合物后立即在纤维蛋白原中的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)以及在打印40分钟后直接从注射器和打印喷嘴获得的生物墨水进行了检查。在细胞培养过程中，细胞活力也保持较高水平（图5B、C）。HUVEC均匀分布在打印的水凝胶内，并且在14天的培养期内没有观察到打印的纤维蛋白结构明显变形（图5B）。因此，在3D MOSAIC平台中应用低粘度生物墨水不仅可以打印细胞相容性水凝胶，还可以为生物打印提供更温和的条件。

图5 生物打印过程和细胞培养期间的细胞活力

随后的研究，作者将细胞水凝胶生物墨水在微网上的可靠印刷扩展到制造更复杂的结构。使用含有HUVEC和肺成纤维细胞(LF)的纤维蛋白原打印五层倒金字塔。生物墨水被打印成轮廓清晰的正方形，尺寸线性增加，HUVEC分布均匀（图6A）。这些层分别培养并在培养第7天组装，组成一个高度约2毫米、纤维蛋白壁厚500微米的倒置空心金字塔（图6B、C）。在制造方面，层的堆叠不受限制，因为微网格有效地固定了印刷的水凝胶结构。重要的一点，3D MOSAIC在模块化微网格生物墨水的空间和时间组装方面非常灵活。

此外，使用基于微网格的生物打印，还可以打印这种天然的低粘度水凝胶来制造复杂的结构（图6D）。共培养第7天，HUVEC形成互连的血管网络，CD31的免疫荧光染色表明内皮细胞紧密连接的形成，这对于血管样结构的稳定和维护至关重要（图6E）。分叉网络分支的共焦图像的正交视图揭示了管状结构内的管腔（图6F）。借助3D MOSAIC平台，通过实施具有生物功能的水凝胶，重建了具有高水平的生物和结构仿生学的生理微环境。

图6 生物打印微型结构内内皮细胞的自组织

4. 多层TME的制造和分析

3D MOSAIC平台能够利用模块化层构建全面的生理微环境。设计并制作了肿瘤微环境（TME）模型，其中跨多个组装层建立了细胞相互作用。TME模型由三个环形层组成，每个层包含MDA-MB-23乳腺癌细胞、纤维蛋白以及HUVEC和LF的组合，代表癌症、细胞外基质和脉管系统成分（图7A、B）。该设计旨在模拟TME内癌细胞与微血管系统之间的主动相互作用。将三层对齐、组装并培养长达1周（图7C）。培养7天后，在 MDA-MB-231细胞的单一培养对照条件下，从其初始层观察到最小的迁移（图7D）。

然而，当HUVEC和LF存在于顶层时，转移性乳腺癌细胞表现出向上迁移，到达中层。此外，观察到HUVEC向下移动，并且还在中间纯纤维蛋白层内发现了HUVEC。顶层的HUVEC在第7天时形成了内皮细胞网络（图7E），如之前在图6中观察到的。通过正交共焦成像证实了MDA-MB-231细胞的垂直迁移（图7F）。随着时间的推移，迁移细胞的数量增加（图7G）。总的来说，培养的细胞表现出活跃的迁移、基质重塑和增殖，证明了只有使用高细胞相容性生物墨水时才有可能实现的高水平细胞生物活性。

图7 多层TME的制造和分析

综上，多学科3D MOSAIC平台提供了一种有前途的策略，可以使用低打印性的天然水凝胶创建复杂的异质3D结构。微网支撑具有毛细管钉扎效应的低粘度水凝胶，以实现高分辨率结构的生物打印，随后将其对齐和堆叠以形成多层结构。在平台中血管生成条件下培养的内皮细胞在生物功能水凝胶内自组织形成血管网络。此外，成功构建了结合癌细胞、细胞外基质成分和血管元件的TME模型，为研究癌细胞与其周围微血管之间复杂的相互作用提供了有价值的工具。

文章来源：
https://doi.org/10.1021/acsami.3c05750