苏黎世大学《Science Advances》：利用生物打印软骨治疗小耳症

来源： EngineeringForLife

小耳症是一种先天性疾病，其特征是外耳在胎儿期发育异常。其严重程度从轻微畸形到完全没有耳廓不等。据估计，全世界每 10,000 名儿童中约有 1.46 人患有小耳症。小耳症对患儿的社会心理健康有很大的负面影响，表现为自尊心下降、社交孤立和焦虑增加。而这些问题往往要到儿童 10 岁时才能得到治疗，这就加剧了这些问题的严重性。目前治疗小耳症的金标准是自体肋软骨重建术，即从肋骨上获取肋软骨，然后在肋软骨上雕刻出耳廓。然后将框架植入颅骨皮下，在第二阶段将耳廓抬高。然而，这是最具挑战性的整形外科手术之一，治疗曲线非常陡峭。手术本身还需要采集足量的肋软骨，因此通常要推迟到儿童 10 岁以后进行。另外，也可以使用多孔高密度聚乙烯（pHDPE）植入物来避免采集肋软骨。这些植入物虽然具有更好的美学效果，但植入部位的并发症发生率较高。

来自瑞士苏黎世大学的Agnes S. Klar团队开发了一种组织工程治疗方法，该方法基于生物打印的自体耳软骨结构（EarCartilage），并结合生物工程人类色素和血管前真皮表皮替代物（EarSkin），在免疫功能低下的大鼠身上进行了测试。本研究证实，EarSkin 的人体工程毛细血管在 1 周内与受体的血管相连，从而实现了快速的血液灌注和表皮成熟。生物工程 EarSkin 显示出分层表皮，其中含有成熟的角质细胞和黑色素细胞。后者位于表皮基底层，能有效恢复皮肤颜色。此外，体内测试表明，EarCartilage 具有良好的机械稳定性，细胞外基质沉积也得到了增强。总之，EarCartilage 与 EarSkin 的结合是治疗小耳畸形的一种新方法，有望克服现有的局限性，改善小耳畸形重建的美学效果。相关工作以题为“Combining bioengineered human skin with bioprinted cartilage for ear reconstruction”的文章发表在2023年10月4日的国际顶级期刊《Science Advances》。

1. 创新型研究内容
本研究展示了人类色素和血管前化皮肤替代物（EarSkin）与生物打印耳软骨（EarCartilage）的结合（图 1）。据本研究所知，这是首次报道将两种组织工程移植物结合起来治疗小耳症患者。在大鼠皮下模型中，EarCartilage 被植入肉阜下，作为 EarSkin 覆盖的颞顶筋膜瓣（TPF）的替代物，这一过程与标准的小耳症手术治疗非常相似。这两种组织的结合为治疗小耳症提供了一种新策略，规避了现有的局限性。通过使用生物制造的耳廓移植物，可以省略肋软骨的采集；通过用组织工程皮肤覆盖耳廓，可以避免框架暴露等并发症，同时改善美学效果。

图1 EarCartilage 和 EarSkin 的组合示意图

生物工程 EarSkin 是一种源自人类的真皮表皮移植体，由 I 型胶原蛋白水凝胶制成，其中包含血管前真皮层和顶部的色素表皮（图 2A）。人真皮微血管内皮细胞（HDMECs）与人成纤维细胞在真皮层共培养，形成分支毛细血管，并在体外培养 2 周内排列成血管丛（图 2B）。随着时间的推移，毛细血管的数量和长度明显增加。细胞角蛋白 19（CK19；人角质形成细胞）和人黑色素瘤黑（HMB-45；人黑色素形成细胞）标记物的全图成本染色进一步证实了角质形成细胞和黑色素形成细胞在皮肤替代物上播种 1 周后在表皮层的均匀分布（图 2C）。此外，二乙酸荧光素（FdA）染色证实了角质形成细胞和黑色素细胞的存活率，并在播种 1 周后完全覆盖了表皮层（图 2D，表皮和真皮 FdA 染色对比）。

图2 体外开发 EarSkin

由于软骨组织的 ECM 成分复杂，因此能够承受巨大的负荷。为了评估软骨构建体的成熟度，本研究对细胞化的对照盘（∅ = 6 毫米，高 = 1 毫米）进行了生物打印（HATG 生物墨水），并随时间评估了其组织成熟度（图 3A）。与之前的研究相比，本研究通过将人EarCartilage细胞（hAUR）的浓度提高到每毫升 1,500 万个，进一步提高了EarCartilage组织的成熟度，并使构建体成熟长达 17 周。打印后，76.3 ± 6.6% 的软骨细胞存活，21 天后增至 92.3 ± 2.9%（图 3B 和 C）。此外，软骨细胞大量增殖，二次谐波发生（SHG）信号增加，表明胶原等 ECM 成分沉积。软骨尤其依赖其 ECM 成分来承受重负荷。因此，组织学染色显示培养过程中沙弗宁 O 染色强度增加，表明糖胺聚糖（GAG）沉积量增加（图 3F）。同样，胶原蛋白 II 的染色强度也增加了，并在整个软骨盘上显示出更均匀的分布。到第 9 周时，整个构建体中都能检测到胶原蛋白 I，但到第 17 周时，染色仅限于构建体的外围（图 3F）。培养 9 周后检测到弹性蛋白开始沉积（图 3F）。

图3 软骨的体外发育

为模拟工程皮肤与软骨的结合，本研究开发了一种体内大鼠模型，用于进行治疗小耳畸形实验（图 4A 和 B）。第一次实验使用 20 毫米直径和 1 毫米高的软骨盘，成熟 9 周后建立模型，以确保在植入耳廓移植物之前软骨、髓核和皮肤移植物之间有充分接触。选择较短的体外成熟期是为了进一步评估软骨移植物在体内是否会向弹性软骨方向成熟。圆盘被植入肉阜下，肉阜相当于临床上用于耳部重建的TPF，在肉阜上移植血管前真皮表皮移植体（EarSkin）。植入后，每周更换敷料时都会对伤口愈合过程进行控制，并对移植物上皮化区域进行拍照记录。对皮肤成熟情况进行了宏观检查（图 4C 至 I），并进行了平面测量（图 4J）。观察到 EarSkin 的色素沉着与表皮层黑色素细胞产生的黑色素有关（图 4H 和 I，白色虚线）。此外，与第 0 天移植的原始 EarSkin 相比，本研究观察到 EarSkin 在 1 周后（72.60 ± 17.52%，n = 6）和 4 周后（75.04 ± 27.95%，n = 3）略有收缩（图 4J）。

图4 活体EarSkin和软骨盘

组织学分析进一步表明，EarSkin-髓核-软骨盘在体内 1 周后紧密相连（图 5A）。在 EarSkin 的真皮层中可以看到用人 CD31 染色的人毛细血管，其周围是用人 CD90 染色的成纤维细胞（图 5C）。此外，通过大鼠 CD31 观察到的大鼠毛细血管只存在于肉阜，这证实软骨盘（CD44 阳性）仍然是无血管的（图 5D）。本研究首先从宏观上评估了移植 EarSkin 的变黑情况，然后用 HMB-45 对黑色素细胞进行染色，进一步验证了这一点。真皮-表皮交界处基底膜的主要成分--人层粘蛋白-5的成本染色证实了黑色素细胞仅位于表皮基底层（图 5E 和 F）。此外，通过对人类细胞角蛋白 10（CK10）进行染色，评估了表皮的成熟和分层情况。此外，本研究观察到 CK19 在体内 1 周（图 5I）至 4 周（图 5J）期间在表皮基底层的表达量减少，这表明 EarSkin 已建立表皮稳态。细胞角蛋白 15 (CK15) 在体内 1 周（图 5I）和 4 周（图 5J）这两个时间点都在 EarSkin 的基底层特异性表达。CK19/CK15 着色模式与在原生皮肤中观察到的模式相似。

图5 EarSkin 和软骨盘的活体评估

组织学和免疫组织学染色证实了软骨盘的组织成熟程度（图 6A）。本研究观察到 GAGs、胶原蛋白 II 和胶原蛋白 I 的沉积，但缺乏弹性蛋白。此外，软骨细胞表现出阳性的 ki67 表达，表明体内 1 周后细胞增殖。为了测试软骨椎间盘的机械性能，本研究进行了压缩和压痕测试。体外成熟 9 周后，压缩模量从最初的 3.6 ± 0.4 千帕增加到 199.1 ± 66 千帕。在体内，压缩模量没有明显变化，1 周后达到 162.7 ± 59.8 千帕，4 周后达到 185.4 ± 13.7 千帕（图 6B）。同样，赫兹模量（压痕）也从最初的 9.4 ± 2.9 千帕增加到体外成熟 9 周后的 36.4 ± 18.1 千帕。在体内，1 周后未观察到明显变化（30.1 ± 18.2 kPa），但 4 周后观察到明显降低（20.4 ± 11.2 kPa）（图 6C）。与本实验中进行的为期 9 周的体外培养相比，对照组圆盘（直径 = 6 毫米，高 = 1 毫米；图 3，D 和 E）的培养期延长了 17 周，这些结果突出表明了充分成熟过程的重要性。

图6 EarSkin 和EarCartilage盘的活体的手术评价

耳廓（EarCartilage）为肉阜和 EarSkin 提供了接近生理的三维表面。因此，本研究接下来在体内将 EarCartilage 和 EarSkin 结合在一起，测试 EarSkin 是否能够覆盖 EarCartilage，而不会在 EarCartilage 和肉阜之间出现空腔或挤出 EarSkin（图 7A 和 B）。根据对照盘的体外成熟（图 3）和软骨盘的体内成熟结果（图 4 至图 6），耳廓移植物在植入前已成熟 17 周。较长的体外成熟期使较大的 EarCartilage 移植物得以在整个过程中成熟。移植后，检查了伤口愈合过程和 EarSkin 成熟情况。虽然没有观察到愈合过程的不良影响，但 EarSkin 的平面测量结果显示，在体内使用 1 周后，EarSkin 有轻微收缩（82.54 ± 30.83%，n = 6），与植入软骨盘顶部的 EarSkin 类似（72.60 ± 17.52%，n = 6）（图 7C 至 I）。血红素和伊红（H&E）染色证实了体内 EarCartilage 和 EarSkin 构建物之间的紧密连接（图 8A）。经 H&E 染色的切片进一步显示，即使对这些移植物进行组织学处理，EarSkin 也未从肉阜上脱落，肉阜也未从 EarCartilage 上脱落。此外，为了准备用于机械测试的样本，必须用剪刀和手术刀小心翼翼地去除耳皮和肉穗，因为它们不容易从EarCartilage上脱落，这进一步证实了这三种组织之间的粘附性。

图7 活体内的EarSkin和EarCartilage

在体内 1 周后，自组装的人毛细血管（CD31）完全出现在由人成纤维细胞（CD90；图 8C）划定的 EarSkin 真皮部分。通过对人 CD31 和大鼠 CD31 进行成本染色，本研究检查了自组装的人毛细血管与预先存在的大鼠血管之间的吻合情况（图 8E 至 G）。在 EarSkin 的真皮部分观察到人鼠混合毛细血管（图 8G，白色箭头），与尚未连接的人（红色染色）和大鼠毛细血管共存。人和大鼠杂交毛细血管的功能性吻合和功能性血液灌注通过人 CD31 阳性毛细血管管腔中存在大鼠红细胞得到进一步证实（图 8H）。大鼠 CD31 和人类 CD44（一种透明质酸的细胞表面粘附受体）的成本染色进一步证实，EarCartilage 仍然是无血管的，没有人类毛细血管的入侵。此外，生物工程 EarSkin 显示出分化和分层的表皮，包括在整个基底上层表达人 CK10 的角质细胞和表明表皮层分层和成熟的人 CD44（图 8I）。人类 HMB-45 染色进一步证实了黑色素细胞完全位于表皮基底层，这与层粘连蛋白 5 的表达有关（图 8J）。

图8 用EarSkin 和 EarCartilage 对 EarSkin 进行活体评估

植入前，EarCartilage 表现出柔韧的弹性行为，边缘的压缩模量达到 459.67 ± 92.17 kPa，中心的压缩模量达到 231.71 ± 108.72 kPa。在体内使用 1 周和 4 周后，EarCartilage 的形态主要保持不变，其压缩模量虽然在体内使用 1 周后短暂下降，但在体内使用 4 周后保持稳定（图 9A，边缘：459 67 ± 92 17 kPa，中心：231 71 ± 108 72 kPa）：17周后为：459.67 ± 92.17 kPa，17 + 1周后为：323.9 ± 74.6 kPa，17 + 4周后为：423.2 ± 234.1 kPa；中心：17周后为：231.71 ± 108.72 kPa，17 + 1周后为：99.9 ± 23.1 kPa，17 + 4周后为：144.9 ± 83.5 kPa）。然而，耳廓结构的赫兹模量仍然明显较软（图 9B，边缘：17 周后为 73.6 ± 55.6 kPa，17 + 1 周后为 28.2 ± 9.0 kPa，17 + 4 周后为 110.7 ± 138.4 kPa；中心：17 周后为 28.9 ± 17.9 kPa，17 + 1 周后为 20.0 ± 6.8 kPa，17 + 4 周后为 30.3 ± 20.6 kPa）。组织学和免疫组织学染色证实，随着弹性蛋白沉积的开始，GAGs、胶原蛋白 I 和胶原蛋白 II 也开始存在（图 9）。与培养 17 周的软骨盘相似，胶原蛋白 I 表明纤维软骨的形成，而弹性蛋白沉积的开始表明这些构建物开始向EarCartilage转变。

图9 用EarSkin 和 EarCartilage 对 EarCartilage 进行活体评估

2. 总结与展望
本研究表明，结合两种组织工程构建物--三维软骨和皮肤--为小耳畸形患者提供了一种先进的个性化治疗方案。软骨组织工程克服了采集肋软骨的需要，因此可以对较小的儿童进行手术。此外，这种方法还可以在耳廓上精确地覆盖与对侧耳皮肤结构和颜色相匹配的皮肤移植体，从而改善重建后的美观效果。最终，本研究证明了 EarCartilage 在体内保持稳定，EarSkin 与宿主的肉阜血管有效吻合，从而实现了快速的血液灌注和较高的体内移植率。不过，今后还需要在免疫功能健全的大型动物模型中进行进一步的体内临床前试验，以评估拟议模型治疗小耳症患者的可行性。

文章来源：
https://www.science.org/doi/full/10.1126/sciadv.adh1890