生物3D打印仿生支架通过双向调控软骨内骨化促进肩关节再生

来源：九院3D打印中心王金武团队

组织工程被认为是一种有潜力的方法，用于重建生物关节，尤其是在治疗晚期骨关节炎方面，但目前在大型生物关节的再生方面还没有取得重大进展。

本研究利用多喷头协同生物打印技术设计和一体化制造了结构差异化、成分异质化、形态曲面不规则的大白兔兔肱骨头再生仿生支架，利用动态力学加压协同不同生化刺激信号实现对软骨内成骨的双重调控。这项研究提供了一种多功能且可扩展的修复大型关节的方法。

仿生支架：用于生物组织工程和再生医学的关键材料，其设计和制造得与自然生物组织相似。仿生支架在晚期骨关节炎患者治疗中发挥重要作用。

骨髓间充质干细胞（BMSCs）：是一种很有前途的骨和软骨组织工程自体细胞来源，通过调节软骨内骨化及微环境中复杂信号的空间调控，从而影响BMSCs的分化方向促进软骨细胞生成，这可能极大地有利于肱骨头的成功重建。

多喷头协同生物3D打印技术：是一种新兴的生物制造技术，它可以采用多种喷头将含有不同生长因子和高密度活细胞输送到水凝胶、大分子和生物材料中，从而创建高度仿生的生物活性结构。研究人员使用这项技术制备具有不同结构、成分的大白兔肱骨头仿生支架，并进行了肩关节置换，用以分析术后兔肱骨关节正常结构再生和功能重建情况。

研究通过计算机断层扫描(CT)兔肱骨近端肱骨头获得3D数据设计生物支架。

图1 基于CAD/CAM技术构建了不同结构和成分的兔肱骨头支架。A-D）新西兰白兔左肱骨头扫描和假体设计效果图。E-H）分层肱骨头设计并打印路径设计。I-L）肱骨头3D打印的制备过程。M，N）打印模型和物理对象。O，P）肱骨头的基底视图和放大图像。

为了验证人工肱骨头的生物相容性，研究人员将每组生物打印支架进行培养1、3、5和7天后用活死细胞染色。BMSC均匀分布在支架之间（图2A，第3天）。在不同的支架中观察到高细胞活力和少量死细胞（超过95%），统计分析表明组间没有显着差异（图2B）。此外，细胞计数试剂盒-8（CCK-8）测定显示细胞增殖随着培养时间的增加而增加。结果表明，所制备的肱骨头支架具有良好的生物相容性，可用于细胞的长期生长。

图2 激光共聚焦扫描用于检测每个支架的生物相容性。A，B）活/死染色显示细胞在刺激1,3,5和7天时的存活状态和细胞存活率，而C）CCK-8测定显示支架中细胞在1,3,5和7天的刺激下增殖。

为了评估动态力学加压协同不同生化因素对支架中不同区域骨髓间充质干细胞软骨形成和软骨内成骨的影响，研究人员采用RT-PCR来评估透明软骨相关基因(II型胶原(COL-II)、聚集蛋白(AGG)和Sry相关HMG -9 (SOX9))和纤维软骨相关基因(I型胶原 (COL-I)、X型胶原 (COL-X)、基质金属蛋白酶-13 (MMP-13))在体外培养1、7、14天后在不同支架中的表达。结果表明，动态力学加压联合PTH双刺激支架能更好地诱导BMSCs成软骨分化，抑制软骨内成骨，而动态力学加压联合羟基磷灰石(HA)可刺激软骨内成骨的发育过程，有利于BMSCs体外成骨。

图3 模拟柱状支架上软骨层和下软骨下骨层软骨内成骨过程相关基因的表达

为了进一步评估生物3D打印肱骨头支架在蛋白质水平上双向调节BMSCs软骨内骨化过程的效果，研究人员在体外培养30天后，对不同支架的外层和内层进行了透明软骨化标志蛋白（COL-II）和纤维软骨化标志蛋白（COL-X）的免疫荧光染色。结果表明，在动态力学加压协同PTH的联合刺激下，软骨层支架中BMSCs中软骨内骨化进程受到较好的抑制，快速生成并维持透明软骨表型；而在在动态力学加压刺激协同HA诱导的组合下，软骨下骨层支架中BMSCs的软骨内骨化进程得到显著促进，快速生成软骨下骨。

图4 体外刺激后COL-II和COL-X的免疫荧光分析

为了进一步评估不同刺激对软骨再生的促进作用，进行了组织学评估，如苏木精-伊红染色(he)、Masson–三色染色(Masson)、番红O/固绿染色(SO/FG)、阿辛蓝染色(AB)和甲苯胺蓝染色(TB)。结果表明，动态力学加压联合PTH刺激可协同促进肱骨头支架表面软骨组织的形成。

图5 各组体外刺激后肱骨头硬组织切片组织学检查

通过对肩关节进行X线和MRI扫描，以评估植入肱骨头修复体的固定和再生组织的形成。结果显示，双刺激组的新生骨体积明显大于其他三组，MRI也证实所有植入的假体均保留在关节内，无脱位；且双刺激组新再生的软骨组织比生物力学和生化组更厚。

图6 肱骨头关节置换术后4个月肩关节的X射线和MRI照片，每组都有人造支架。LA：侧视图，AP：前视图和后视图，T1：T1加权成像，T2：T1加权成像，PD：质子密度加权像。

为了进一步验证再生肱骨头软骨和骨的形成情况，实验动物在关节置换术后4个月安乐死，并收集标本进行大体观察。

图7 半肩关节置换术后肱骨头软骨再生的组织学检查

最后在软骨下区域进行HE、Masson、Van Gieson (VG)、SO/FG、AB和TB染色，结果表明，生物力学刺激促进再生软骨组织的软骨内成骨过程，加速成熟骨组织的形成。

图8 体内半肩关节置换术后肱骨头软骨下骨再生的组织学观察

该研究展示了一种生物3D打印关节仿生支架，它具有类似于天然肩关节肱骨头的各向异性组织结构和多样化成分。研究通过动态力学加压协同不同生物化学刺激双向调控干细胞内的软骨内骨化进程，实现了关节表层透明软骨和关节下骨的一体化再生。这种应用支架架构、生物化学和生物力学协同刺激的方法可能对大型关节的高效再生产生深远影响，有望在动物肩关节重建以及其他大关节（如膝盖、髋部和腕关节）重建领域取得进展。此方法还为设计和制造大型、解剖匹配的临床相关植入物提供了一种借鉴方案。该研究通过应用生物力学和生物化学刺激以及各向异性结构，有望进一步推动生物3D打印大关节的发展。