3D打印组织模型：从水凝胶到生物医学应用

来源： GK绿钥生物科技

米兰比可卡大学生物技术与生物科学系Laura Russo教授团队在《Journal of Controlled Release》期刊发表综述“3D printed tissue models: From hydrogels to biomedical applications”文章简要介绍了细胞外基质（ECM）的形态和生化特性对于开发类似于人体器官和组织结构和功能特性的新型先进结构的重要性。作者描述了ECM在不同组织、器官、健康和病理状态下的形态和生化特性如何变化，以及如何通过生物打印生成具有所需特性的ECM模拟物。作者介绍了3D打印过程中生物墨水水凝胶的天然和合成的聚合物材料，特别介绍了它们的功能化与对生物信号分子交联和共轭的效果，以指导开发生物响应和生物指导ECM模拟物。

生物3D打印的出现为组织工程和体外先进组织模型开辟了新的机会。生产先进3D组织模型的难点在于合成适合的生物墨水。同时生物墨水能够提供诱导不同细胞产生新基质的信号，理想地再现特定体内细胞环境。事实上，用于开发油墨和生物墨水的传统方法主要集中在控制水凝胶的物理性质上，而忽略了水凝胶材料对生化信号的影响。

在肿瘤微环境（TME）中， ECM的机械特性和结构与肿瘤恶性肿瘤和转移潜力密切相关。在组织纤维化中ECM成分的异常沉积是主要驱动因素之一。ECM的刚度对机械诱导途径的影响已经有大量的研究。一些研究强调了物理性质在驱动细胞粘附、组织、代谢和信号传导方面的重要性。机械诱导过程是研究最多的ECM-细胞相互作用机制之一，受细胞表面整合素调控。它是一种动态机制，通过对沉积速率和特性的精细控制来调节新合成的ECM组分。ECM在维持组织稳态或诱导病理状况方面也通过其他机制（如细胞受体相互作用）控制。蛋白聚糖、酶、生长因子和多种生物大分子诱导信号级联反应，其调节作用如表1所示。

表1 具有调节作用的主要生物分子

ECM重塑是一种动态机制，它允许不同的细胞群在更合适的微环境中存活并发挥其功能。细胞群包括干细胞和分化细胞、免疫系统细胞。当这些成分的生理相互作用或重塑变得异常时，就会发生慢性或急性病理现象。ECM特性不仅仅是特定组织阶段的结果，而且在组织形态发生的进展和功能的维持中起着关键作用。
表2报告了与不同病理相关的ECM特征示例。生成人造组织的生物3D打印结构的设计必须从ECM在不同器官、生理和病理状态下的特性中找到规律。

表2 病理条件下ECM调节的例子

作者认为用于开发 3D 生物打印模型的细胞友好型聚合物的选择取决于它们与不同细胞群的相容性。随着3D打印工艺和仪器的进步，大量基于天然和合成聚合物的生物墨水也被重新分类、定义和标准化。聚合物的分类主要包括天然聚合物和合成聚合物。

图2 用于配制油墨和生物油墨的天然（多糖和蛋白质）和合成聚合物的选定实例

天然聚合物和合成聚合物具有不同的特性、优点和局限性。天然聚合物的优势在于其天然的生物相容性，而合成聚合物缺乏细胞命运调节所需的生物分子基序，但提供了对机械和结构特性的改进控制。研究人员将天然和合成聚合物结合开发了多种用于生物打印的混合型生物墨水，可适用于打印生成具有可定制形态和细胞特异性的三维ECM模拟物。

在生物打印方法中，细胞群或类器官在打印过程之前、期间或之后包埋在水凝胶或水凝胶前体中。在生物打印过程中必须保证细胞活力，另一方面，墨水中残留细胞的存在会影响生物墨水的打印性，并最终影响构建体的结构保真度。

图3 生物墨水与普通打印墨水

作者介绍了生物可打印聚合物的物理和化学交联。生物3D打印结构是使用能够产生物理交联的生物墨水生成的，定义为“物理水凝胶”。物理水凝胶是由通过不同相互作用相互连接的聚合物获得的，包括离子和疏水相互作用或热转变，最近，人们探索了自组装肽作为生物相容性生物墨水，可以轻松通过控制pH值或添加二价离子形成物理交联。即使物理水凝胶在易于制备构建体方面具有明显的优势，但可采用的聚合物数量有限以及难以准确控制机械和生化性能会损害应用方向。最近的工作主要集中在混合或多组分生物材料的开发上，其中物理和化学交联策略相结合，利用可逆共价键产生动态水凝胶（图4）。

图4 A：测试的打印条件和相图，以在打印性能、挤出性和均匀性方面实现最佳油墨开发。B：具有网格状3D多孔结构的支架示例

细胞相容性和偶联方法的验证是开发高级可定制生物墨水的重要方法。表3收集了物理交联和共价交联方法的实例，包括动态交联和可逆交联方法。

表3 部分用于油墨和水凝胶的静态和动态交联的共轭方法

作者随后就对水凝胶特性的控制做了描述。ECM在细胞命运中的指导性作用不仅取决于材料的物理性质，还取决于其化学成分以及提供特定相互作用和信号级联的不同生物分子的存在。因此，功能性ECM模拟物的开发必须包括此类生物活性因子，其含量、浓度和梯度将改变构建体的功能。聚合物分子的片段，特别是肽序列（如RGD）以及效应蛋白（如生长因子或酶）。它们的作用是多方面的，包括正确的细胞基质粘附，对细胞存活至关重要，与细胞受体（整合素、选择素等）相互作用以启动信号级联，甚至是诱导功能变化的酶促过程。

随后，作者描述了将天然ECM生成功能化ECM模拟物最具创新性的方法是将天然ECM或将其特定蛋白片段加入可打印的生物墨水聚合物中。

图5 A：猪（p）和牛（b）来源的脱细胞组织用H&E染色。去除细胞物质后残留的脱细胞细胞外基质呈粉红色。B：在铣削前扫描每种脱细胞组织类型的电子图像，突出显示独特的多孔和纤维结构。C：铣削产生的用于生活用纸制造的dECM粉末的扫描电子图像。

表4 ECM 模拟使用dECM生成的

将dECM 与其他聚合物结合使用的最有前途的方法学方法（表5）。De Santis等人报道了基于dECM增强的藻酸盐的可打印生物基质的合成; Pati等人利用分别从猪软骨和心脏获得的dECM来生产不同3D结构的生物墨水。如图6所示，作者分别使用心脏dECM（hdECM）、软骨dECM（cdECM）和脂肪dECM（adECM）与聚己内酯（PCL）相结合，制作了心脏构建体、软骨构建体和脂肪构建体。所有获得的构建体都允许产生具有增加均匀细胞分布的组织类似物，并具有脂肪生成和软骨生成潜力。Kim等人提出了用明胶强化猪肝dECM的方法，该团队将开发的dECM粉末基生物墨水（dECM pBio-ink）与明胶和dECM基墨水（图6 ii）进行了比较，结果相比dECM更具有可观的机械性能以及与内皮细胞和原代肝细胞的生物相容性。对dECM组分进行了功能化能更好地控制dECM增强油墨的降解速率和力学性能。

图6  i：由dECM和PCL制成的载细胞结构用作生物墨水；ii：显微镜图像 （比例尺：200 μm）和测量的形状保真度具有不同孔径的2% dECM pBio-ink的打印晶格图案。3种生物油墨的肝形结构打印效果；iii：开发肾小球前模型。

图7 i:纤维蛋白脑模拟生物墨水与3D工程打印可灌注血管网络集成; ii:3D生物打印许可复制基于光交联肝脏dECM的水凝胶

作者继续描述了关于生物3D打印模型的应用相关内容。3D打印技术的进步以及对病理和健康状态下ECM特征的了解的增加，使得生物打印结构能够更好地模拟组织的形态、生化和功能特征。在体外建模中，重现人体细胞的3D组织模型，控制其物理和生物分子特性，并确定相关细胞命运的能力，将极大地有助于我们了解几种疾病发病机制中的关键参与者。生物3D打印在再生医学中的应用是一个有吸引力和挑战性的话题。生物3D打印在再生医学中的应用主要集中在骨软骨和心血管疾病上（表6）。

表5 通过生物打印获得的组织和体外模型的例子

即使组织可扩展性和功能性仍然是一个开放的挑战，建立具有可定制形态的多细胞结构的能力对于功能性组织和器官替代品的生成是有利的。该领域的新趋势包括直接在体内进行的生物3D打印，手术中生物打印（IOB）或原位生物打印对软骨、皮肤和骨骼在内的不同组织具有明显的成效。Albanna等人将生物3D打印系统应用于小鼠和猪模型中的自体或同种异体真皮移植。在这里，研究人员将真皮成纤维细胞加入至牛纤维蛋白和I型胶原水凝胶中，并在真皮层受伤的部位中进行逐层生物打印，促进皮肤再生。即使作者观察到早期形成的真皮层和成熟的真皮层之间存在差异，但所提出的方法也为具有高转化潜力的新治疗机会开辟了道路（图8）。

图8：皮肤生物打印机原型和原位生物打印概念：i：演示皮肤生物打印机规模的示意图; ii：系统的主要组成部分;iii：皮肤生物打印概念; iv和v皮肤生物打印过程的例子

总结：3D打印和生物打印工艺正在成为适用于不同生物医学领域的强大技术。在再生医学领域，这些技术允许开发更准确和功能更强大的3D组织模型，甚至是可用于先进的生物测定和个性化药物测试的器官模拟。该文章中的许多应用和未来富有想象力的应用，包括功能器官的复制。挑战在于能够合理化细胞命运与ECM结构的许多变量之间的相关性，以及在3D模型中准确再现各种结构和生物分子特征的能力。

文章来源：https://doi.org/10.1016/j.jconrel.2023.01.048