《Biomaterials》综述：3D组织模型的研究进展与临床前应用

来源： EngineeringForLife

传统的二维（2D）细胞培养和动物相关实验在精确评估药物毒性和临床疗效方面存在局限性，导致药物开发过程较为困难。三维（3D）体外模型作为替代平台应运而生，它能够准确模拟体内条件，提高候选药物临床效果和毒性的筛选能力。研究发现，三维模型能准确表现人体复杂的组织结构，可广泛用于疾病建模。生物医学、材料和工程领域在制造各种三维体外模型方面取得重大进展，与传统模型相比，这些模型具有更好的疾病进展预测能力和药物疗效，为新药研发提供更加有效的平台。近日，来自美国宾夕法尼亚州立大学的Ibrahim T. Ozbolat教授和赣南医学院彭维杰教授团队进行了3D组织模型：生物制造技术和临床前应用的相关综述。成果以“A comprehensive review on 3D tissue models: Biofabrication technologies and preclinical applications”为题于11月27日发表在《Biomaterials》上。

本综述重点介绍了三维体外组织模型在临床前应用方面的最新进展，包括肝脏、骨骼、胃肠道、肾脏、心脏、大脑和软骨等多个器官和组织的药物筛选以及疾病建模。还讨论了为特定器官制造三维模型的策略及其优势和缺陷。此外，本文还阐述了未来建立与生理微环境相关三维模型的考虑因素，并提供了有关知识产权、行业发展和监管环境的独特视角。

图1 利用不同细胞来源制作三维组织模型的制造过程，针对特定器官进行疾病建模和药物筛选

在过去几十年中，用于疾病建模和药物筛选等临床前应用的不同类型的三维体外模型制造技术取得重大进展。这些进步为其在制药领域的应用带来新机遇。本文回顾了用于药物筛选和疾病建模的三维体外组织模型的最新进展，这些模型适用于各种器官和组织，如图1所示：肝脏、胃肠道、肾脏、心脏、大脑、骨骼和软骨。本文还探讨了当前为特定器官创建三维模型的生物制造技术，并讨论了其优势和局限性。

一、构建三维组织模型的生物制造技术

与二维模型相比，三维模型的优势已经得到广泛研究，加速了三维模型生物制造技术的进展。本节重点介绍开发三维模型的各种生物制造技术，包括异细胞球、水凝胶支架、微流体、有机体、生物反应器和三维生物打印组织，如图2所示。

图2 用于构建三维组织模型的常用生物制造技术

1.1 球面模型

球状细胞是具有强细胞间粘附性的细胞团，类似于一小块组织，可通过各种技术进行制造。以前球体模型是用悬滴技术培育的，这种方法可使细胞先形成细胞簇，然后聚集成小悬浮液。该技术可以在常见试管、玻璃和孔板中培育球体。在药物评估领域，悬滴技术的主要问题是其有限的细胞培养体积使药物导入过程复杂化，尤其是在涉及培养基更换时，限制其在高通量应用中的使用。作为一种替代方法，通过使用涂有非反应性基底的孔板抑制细胞粘附到塑料表面，可以生产出更大培养体积的球形细胞。粘附性低的孔板可促进细胞与细胞之间的相互作用，促进球状结构的形成。该技术通常用于研究肿瘤球体内的药物反应。该技术操作简单、成本低廉、可重复性强、可与多种肿瘤细胞系兼容，适用于中高通量的药物筛选。但是其灵活性受到限制，因为球形细胞可在培养基中自由漂浮，妨碍培养基的更换过程。有些细胞系由于粘附素表达受限，在低附着环境中无法自然形成球形结构。

1.2 水凝胶支架
ECM与细胞之间的相互作用以及这种相互作用如何影响细胞形态和生物学变化对药物筛选尤为重要，这促使研究人员利用类ECM生物材料进行三维模型的生物制造。其中，最常见的方法是将细胞包裹在与原生ECM特性相似的水凝胶中。根据制备水凝胶的材料来源，可分为天然水凝胶和合成水凝胶两类。

1.3 新兴生物制造技术
基于微流控技术的微生理系统以及器官芯片技术一直是制造三维模型的先进平台。这些技术可以控制细胞之间的相互作用以及ECM与细胞之间的相互作用，并实现灌注功能，但要将细胞-细胞和细胞-ECM之间的相互作用应用于微孔板的高通量筛选工具则具有挑战性。与此相反，三维生物打印作为一种创建高通量三维模型的技术已经较为成熟，能够加入可调ECM成分以模拟体内条件。这些特点使该技术尤其适合药物筛选。

图3 用于构建三维组织模型生物制造技术的优缺点

二、用于药物筛选和建立疾病模型的三维组织模型

2.1 肝脏
肝脏是维持体内平衡的主要器官，在氨基酸、脂类、异源物代谢、蛋白质、葡萄糖、凝血因子和胆汁生成方面发挥重要作用。在过去十年中，许多研究工作都集中在肝脏模型的开发上，这些模型可模拟肝脏功能。用于研究肝脏疾病相关机制和药物的影响。二维培养的原代人肝细胞（PHHs）是评估药物作用和毒性的重要模型。然而，这种模型会迅速丧失肝细胞功能。其他肝细胞系也因功能不全和缺乏体内研究微环境而受到限制。三维肝细胞模型为研究肝脏疾病、评估药物代谢和药代动力学（PK）提供前景。目前已开发出一系列用于肝功能研究的不同三维肝病模型，可用于急性和慢性药物肝毒性预测、肝纤维化、脂肪肝、肝硬化和肝癌药物筛选。三维模型能更准确地揭示肝病的机理，使其成为更好的药物筛选平台。

图4 用于筛选抗癌药物（包括多柔比星(DOX)和顺铂(CIS)）的三维内皮化肝肿瘤模型

2.2 胃肠（GI）道
消化道是指从胃到肛门的消化道，包括胆囊、小肠、大肠和直肠。是消化系统的主要通道，在食物消化、营养吸收、免疫保护和激素合成过程中发挥重要作用。消化道疾病的高发病率仍然是影响公众健康的一个重要问题。针对这一健康问题的研究日益增多，临床前药物测试依赖于体外模型得出的数据。最近关于三维方法的研究得到进一步应用。用于评估药物和个性化治疗疾病建模的三维消化道模型正在逐步建立。

图5 消化道三维药物筛选模型

2.3 肾脏
肾脏是药物毒性作用的主要器官之一，肾脏损伤的早期阶段很难被发现。患者通常在肾脏严重受损甚至肾功能衰竭时才会知道。据统计，在新药研发阶段参与临床试验的候选者中，有30%的人因意料之外的肾毒性和不良反应而退出临床试验过程。因此，一个可靠的肾毒性预测模型可以保证临床用药的安全性，大大降低药物开发的风险。近端肾小管是肾脏的敏感区域，药物的代谢排泄过程通常发生在肾小管上皮细胞上。因此，肾毒性的早期预测在很大程度上依赖于近端肾小管。

图6 模拟肾小球的三维球体模型，有助于快速筛选药物

2.4 心脏

药物诱发的心脏毒性可导致严重的心血管疾病，如心肌坏死、心肌梗死和严重的致命性心律失常，从而导致药物开发终止或退出市场。抗组胺药物特非那定（Terfenadine）就是这类药物的一个例子，它会阻塞心脏钾通道，导致动作电位延长，使心电图（ECG）上观察到的QT间期显著延长。最终导致严重的心律失常，并可能导致死亡。抗生素、镇静剂和抗抑郁药等药物也具有类似作用。心脏毒性通常在细胞培养中进行评估，无法提供人体组织的真实情况。另一方面，动物模型与人体缺乏转化相关性，因此采用三维人体心脏模型是一种可取的方法。

图7 利用从正常人体内获得的心脏成纤维细胞和iPSC-CM生成组织的示意图

2.5 骨骼和软骨
大量研究表明，三维模型中的细胞与二维模型中的细胞形态不同。细胞形态对细胞生长、成熟、细胞程序性死亡以及遗传物质和蛋白质的合成等都有显著影响。与二维培养的成骨细胞和软骨细胞相比，三维培养的细胞增殖率较低。此外，多项研究表明，三维模型具有增强成骨或软骨作用的能力，三维细胞通常具有与体内组织基本相似的基因表达谱。研究还发现，不同骨和软骨模型具有不同的药物敏感性。细胞在三维模型中通常比二维模型表现出更强的抗药性，二维模型可能是体内药物反应的更好载体。

图8 利用基于支架的方法生产PLMA水凝胶并创建体外OS模型

2.6 脑
全球约有六分之一的人受到神经系统疾病的影响，这些疾病包括精神分裂症、癫痫、老年痴呆症、脑肿瘤等。目前，研究人员主要依赖于传统的动物模型，但动物模型存在一些局限性，如成本高、耗时长，而且动物治疗往往在临床试验中失败，因此，为了解神经系统疾病的病因和进展促使研究人员寻求替代模型，以更好揭示神经系统疾病并发现潜在的治疗方法或药物。为模拟三维神经组织的复杂性，神经类器官是药物发现领域的主要模型。

图9 人类脊髓类器官组织（hSCOs）的生成过程

三、建立与生理相关微环境的要求

组织结构和机械特性在调节各种生物活动方面起至关重要的作用，包括干细胞分化、癌症进展和对抗癌治疗的反应。微环境（包括ECM成分、硬度等）控制细胞行为，并决定细胞对周围ECM环境的反应。要创建仿生三维模型进行有效药物筛选，细胞、生物材料、制造方式和刺激物的适当组合至关重要。一般来说，微环境可以通过组织物理、化学和生物特征反映出来。物理特征通常包括ECM排列、硬度和组织微结构。化学特征包括ECM成分和细胞因子，生物特征包括细胞组成和细胞间作用、自分泌和旁分泌、血管和神经支配等。为设计出有效的体外药物筛选装置，在选择细胞、生物材料、制造方式以及随后的组织成熟过程时，都应考虑这三个特征。



四、知识产权、行业和监管环境
尽管三维模型已具有在药物开发领域替代动物模型的可行性，但在药物开发过程中，研究人员可能会对替代动物模型表现出一定程度的犹豫，这需要研究人员、工业界和监管部门的共同努力。在生物制造技术中，生物打印因其具有自动化和标准化处理的潜力而极具吸引力和前景。人造组织/器官类别主要应用于工业和研究领域，其中药物测试、疾病模型研究和毒性评估是最多的应用。然而，缺乏经过验证的科学验证和法规是应用生物打印人体组织推动药物开发的重要障碍。监管机构批准新技术所需的科学验证可通过生物打印模型测试来实现。如果这些模型能够可靠预测人体毒性，那么它们就会得到科学界的认可，这自然会导致随后的监管调整。总之，研究人员应积极寻求和收集来自各种实验的充足数据，以增强使用生物打印模型的信心。因此，随着时间的推移，这些模型很可能会因支持证据的不断增加而获得监管部门的认可。不过，在实验室应用的初期阶段，这些模型只能作为动物实验的补充。除进一步工业化进程外，样品的一致性对标准药物筛选方案和结果可靠性尤为重要。三维生物打印模型应在结构、功能和成熟度方面保持高度一致。总之，三维生物打印和医学研究的进步需要克服目前的障碍。因此，为未来做好准备对于从事知识进步的研究人员、技术、行业以及支持和资助这些活动的政府都至关重要。

五、总结与展望
三维组织模型在临床前应用方面的进展和利用仍处于初级阶段，而三维模型使用的日益增加为高效筛选药物用于后续临床前试验提供平台，可提供更快的结果和更优的成本效益。随着创新技术的不断进步，三维模型也在努力创造出能够大规模精确模拟体内环境的模型。确保了其适用药物筛选过程。从简单的球体到有机体，三维模型已经发展到微流控芯片与生物打印相结合，在调整生物材料的动态环境中构建异细胞，以配合实时分析。个体化疗法为最受欢迎的前瞻性应用之一。考虑到三维模型的复杂结构及其模拟体内环境的能力，规范药物筛选实验方案并满足量化标准变得至关重要。来自大量研究的充足数据应得到科学验证。因此，监管机构和制药公司可能会将三维模型作为加强和简化药物开发过程的重要工具。

文章来源：
https://doi.org/10.1016/j.biomaterials.2023.122408