体内3D打印器官！双交联工艺生物墨水法发了《Bioact. Mater.》

来源： EngineeringForLife

移植组织和器官短缺是临床急需解决的问题。原位三维打印技术可直接在患者体内打印出新的组织或器官。但是这一过程中使用的打印墨水对结果至关重要，必须满足特定要求，如快速凝胶化、形状完整、长期稳定以及与周围健康组织粘附特性。在天然材料中，蚕丝纤维素具有优异特性，因此在组织工程和再生医学中广泛研究。但蚕丝纤维素还需进一步改进，才能满足原位三维打印的要求。近日，来自意大利特伦托大学的Antonella Motta教授团队进行了使用双交联工艺丝素蛋白墨水进行原位3D打印的相关研究。研究成果以“Silk fibroin-based inks for in situ 3D printing using a double crosslinking process”为题于01月25日发表在《Bioactive Materials》上。

本研究利用共价交联工艺（包括打印前预光交联和原位酶交联），开发出可用于原位打印的蚕丝纤维素油墨。对两种不同分子量的蚕丝纤维素进行表征，共价键与剪切力协同效应增强蚕丝二级结构向β片层转变，实现快速稳定。新开发的丝素蛋白水凝胶具有良好的机械性能、长期稳定性和耐酶降解性，在14天内其二级结构和膨胀特性不会随时间推移而发生显著变化。此外，体外实验也证明其具有明显的组织粘附性。

本文从以下几个方面进行详细描述：
1. 蚕丝纤维素墨水的开发
2. 蚕丝纤维素墨水的表征
3. 体外生物评估

图1 双重交联工艺设计与流程

使用挤压式3D打印技术，其墨水必须具有剪切稀化特性、在挤压过程中形成长丝以及合适的粘度。蚕丝纤维素不符合这些参数。设计的第一步就是克服粘度限制。研究人员选择两种不同的蚕丝分子量：15 mB和30 mB，以及能形成共价键的交联工艺，以实现对结构、降解和机械性能更多控制。设计了一种双重交联工艺，由预凝胶阶段和原位二次交联组成，前者是为使蚕丝纤维素可挤出，后者是为稳定打印结构（图1）。打印喷嘴中挤压应力诱导的物理交联作用是使无规线圈快速过渡到β-片层结构，从而进一步稳定凝胶。打印出的凝胶形成机械稳定系统，支持骨髓间充质干细胞粘附和存活，并在模拟组织上具有良好粘附性。

图2 可打印墨水粘弹性分析

由于预凝胶是通过光交联实现的，因此研究人员进行TNBS检测研究与GMA的甲基丙烯酸化反应是否成功进行，从而量化甲基丙烯酸酯基团对伯胺的取代度（DS）。结果发现，DS等于67%±3%。之后，为进行预交联，对甲基丙烯酸酯蚕丝纤维素（Sil-Ma）进行光交联，从而形成不完全共价交联凝胶（PC）。酶促交联（EC）取决于许多变量，如温度、自由基、蚕丝浓度、过氧化物浓度以及蚕丝分子量，因此在用作预交联工艺时会出现差异。考虑到蚕丝纤维素的氨基酸组成，酪氨酸约占总量的5%，酪氨酸内键可形成高度稳定、富有弹性的水凝胶。为研究双交联（DC）方法是否可进行打印，并验证酶交联（EC）是否会导致完全凝胶化，进行流变学分析。为评估可打印性，对不同成分进行粘弹性研究。比较了双交联（DC）和光交联前条件（PC），并添加完全光交联凝胶（FC）和完全酶交联凝胶（EC）作为对照。所有条件都具有粘弹性特性，G′高于G''。15mB预交联产生可挤出的均匀长丝，而其他条件则会导致喷嘴堵塞、异质凝胶化（如EC）和更高挤出压力。主要因为与15mB Sil-Ma相比，30mB Sil-Ma的分子量较低。分子量越低，链的缠结和长度就越少，从而影响动力学。因此，光交联效率取决于蚕丝的分子量和浓度，与高分子量制备的Sil-Ma相比，会产生较弱的凝胶。不过，虽然在30mB分子量的情况下，所有条件都出现一个流动点，但挤压EC和FC所需的高压及其在重复试验中的变化，使预交联条件的选择变得明确、可重复，并产生更均匀的丝线。

图3 双交联工艺（DC）打印参数及结构分析

研究粘弹性特性后，在LVE区域进行长时间流变测试，结果表明，预交联形成的预凝胶具有较低的储存模量。相比之下，将这种预凝胶与HRP交联（双交联DC）结合在一起会形成一种均匀的水凝胶，与前一种条件相比，G'明显更高。在所有参数中，凝胶化主要受蚕丝分子量和浓度影响。酶有一个初始延迟阶段，在这一阶段检测不到凝胶化，蛋白质仍然是液态的。然后，酪氨酸键形成，接着是链间蛋白质交联。随着时间推移，这些动力学过程会导致进一步聚合，直到酪氨酸键完全共价形成。双交联条件（DC）下的储存模量在72小时内有所增加。PC条件并没有随着时间的推移而出现显著变化，以上结果证实，预交联不足以形成稳定的均质凝胶，而双交联则能形成适当的凝胶。流变分析结果表明，全交联凝胶（酶解交联、光固化交联和双交联凝胶）需要高压才能挤出，而且PC不足以形成稳定的水凝胶，第二次原位酶解交联是进一步诱导聚合物链之间共价凝胶化的必要步骤。因此，在进行三维打印时，先进行预光交联，然后在原位激活酶交联。

图4 细胞在水凝胶中培养特性分析

图5 使用25G喷嘴在皮肤表面进行双交联Sil-Ma原位打印

将骨髓间充质干细胞接种在样品上后，对其代谢活性和细胞粘附性进行分析。所有条件都支持细胞存活7天以上。在1-7天，检测到细胞代谢活性明显增加，不同测试条件和不同分子量之间没有明显差异。对细胞在基质上粘附情况进行分析显示。第 天，细胞倾向于相互影响，形成细胞簇，并出现一些突起。培养7天后，细胞在所有条件下都呈现拉长、伸展的形状。蚕丝纤维素的氨基酸组成以及地形、孔隙率、刺激和硬度等因素对细胞在三维材料上的行为至关重要。预交联（PC）和双交联（DC）条件下细胞粘附力和细胞形状没有任何差异，表明细胞与材料相互作用的驱动力可能导致蛋白质重排。接着从体内应用角度出发，在皮肤表面进行双交联条件下的3D打印，研究挤出墨水是否粘附在基底上。结果显示Sil-Ma墨水附着在皮肤上倒转基底时没有发生脱落。蚕丝纤维素因其氨基酸组成而具有粘合特性，蚕丝氨酸极性侧链通过形成氢键在与基质相互作用方面起关键作用。这些相互作用也可归因于预交联阶段不完全凝胶化，从而产生粘性预凝胶，通过在原位完成凝胶化，使凝胶在组织内实现物理交联。总之，以上研究结果表明，蚕丝纤维素可通过结合两种不同交联过程（包括光交联和酶交联）来满足原位3D打印要求。此外，3D打印后水凝胶表征为进一步优化打印形状以更好模拟组织复杂性提供有价值的数据。

总结与展望
本文开发了用于原位3D打印基于蚕丝纤维素的生物墨水。该工艺的多功能性在两种不同分子量蚕丝纤维素上得到验证，通过调整制造工艺（即光照时间），原位3D打印得以实现。此外，研究人员开发了一种双重交联工艺，通过不完全光交联进行的预凝胶化与HRP驱动的原位凝胶化相结合。使得水凝胶在介质和水中都能保持稳定，在有X、IV型蛋白酶存在的两周内实现降解。此外，喷嘴中挤压应力诱导的物理交联作用导致无规线圈向β片状结构快速转变，从而在水和介质膨胀过程中提供稳定性。虽然PC和DC都是原位凝胶形成的良好候选材料，但它们之间的主要区别在于后者酶促共价交联的协同效应。一方面，共价键不会影响蚕丝的二级结构，另一方面，与预交联水凝胶相比，共价诱导的水凝胶在蛋白酶作用下更耐降解。表明蚕丝纤维素生物墨水特性可根据最终应用进行调整。使用的墨水浓度都较低，但通过共价交联与物理交联相结合，获得的水凝胶在压缩模量和膨胀性上都十分优异。这简化了制造过程，避免蚕丝纤维素浓度调整等步骤，从而提高凝胶结果的一致性。该生物墨水未来将进一步促进体内原位3D打印研究的进展。

文章来源：
https://doi.org/10.1016/j.bioactmat.2024.01.015