华西口腔郭维华IJB：利用挤出式3D打印构建HERS-DPCs/GelMA支架促进牙槽骨再生

来源： EFL生物3D打印与生物制造

赫特维希上皮根鞘（HERS），是牙发育过程中内釉上皮和外釉上皮向根尖方向生长形成的双层上皮结构，HERS内侧是牙乳头细胞（DPCs），在牙根发育过程中，HERS可诱导DPCs分化为成牙本质细胞，后者参与根部牙本质的形成。然而，HERS仅在牙根发育的特定时期短暂出现，原代HERS细胞数量少、不易获取，常规的二维培养环境容易使其上皮特性丢失，从而失去诱导间充质细胞分化的功能。如何维持HERS的上皮特性，充分发挥上皮间充质间的相互作用，是牙及其支持组织再生研究的一个难点。

最近，四川大学华西口腔医院的郭维华教授团队基于挤出式3D生物打印技术利用GelMA水凝胶重组SD大鼠来源的HERS细胞和DPCs，并通过体内实验来验证HERS-DPCs/GelMA支架的成骨能力。相关论文“3D-bioprinted Recombination Structure of Hertwig’s Epithelial Root Sheath Cells and Dental Papilla Cells for Alveolar Bone Regeneration”发表在International Journal of Bioprinting杂志上，第一作者为唐慧琳硕士，通讯作者为郭维华教授。

该研究的总体思路是根据牙发育过程中HERS和DPCs的空间位置关系设计“层状结构”模型，以GelMA水凝胶为支架材料，通过挤出式3D打印技术构建HERS-DPCs/GelMA结构，并将支架植入SD大鼠的牙槽窝缺损，验证该支架产生矿化组织、促进牙槽骨缺损修复的能力，为牙相关组织工程和上皮-间充质相互作用研究提供新思路。

首先，研究人员从SD大鼠乳鼠牙胚中获取HERS细胞和DPCs，光镜下观察到HERS细胞成团生长，形状如铺路石，DPCs则呈长梭形。免疫荧光染色结果显示：上皮细胞标志物CK14和间充质细胞标志物Vimentin在HERS细胞中均呈阳性表达，提示HERS细胞已发生上皮间充质转化，同时具有上皮和间充质细胞的特性（图1，A）。

然后，用10% w/v的GelMA溶液分别重悬HERS细胞和DPCs，获得细胞密度约为1×106/ml的生物墨水用于3D打印。该研究利用挤出式3D打印机的两个打印头，可实现两种生物墨水的组合式打印，如先打印一层HERS细胞，接着打印两层DPCs，制备HERS-DPCs立体层状结构，同样大小含单一细胞的立体结构作为对照。活/死细胞染色实验的结果显示，在培养后的第1、4和7天，GelMA支架中活细胞比例均在80%以上，证明GelMA有优异的生物相容性，适宜细胞的生长（图1，B和C）。

图1 HERS细胞的分离、培养、鉴定和活力

为了进一步探究HERS-DPCs/GelMA支架中两种细胞的相互作用，研究人员利用荧光染料DiO和DiL分别将DPCs和HERS细胞标记为绿色和红色，并在共聚焦显微镜下于三维打印后的第0、3和8天进行观察，结果发现，第8天时，两种细胞发生迁移，二者的界限也变得模糊（图2）。

图2 体外HERS-DPC相互作用

光镜和扫描电镜的结果表明，3D打印的立体层状结构呈网格状，孔隙均匀，直径约为0.8 mm。从培养后的第3天开始，细胞从GelMA支架中爬出，并大量增殖，第4天时的细胞汇合度高达80%，表明此时的细胞生长状态良好。随后，研究人员通过SD大鼠的牙槽窝移植实验评估HERS-DPCs/GelMA支架的骨再生效果。该实验分为5个组，分别为空白组、HERS细胞（3D）组、DPCs（3D）组、HERS-DPCs（3D）组和HERS-DPCs混合组，空白组不植入任何材料，HERS-DPCs混合组是将两种细胞直接与GelMA水凝胶混合，不进行3D打印。选取8周龄的雌性SD大鼠，拔除右上颌第一、第二磨牙，然后用牙科种植机预备牙槽窝，将样本植入后严密缝合（图3）。

图3 打印结构的显微观察及牙槽窝移植

观察8周后取材进一步分析。HE、Masson染色结果显示各组手术区域均有新形成的胶原纤维，空白组的纤维相对更少、更薄。免疫组化染色结果表明：DPCs（3D）组和HERS-DPCs（3D）组的成骨相关标志物（COL-I、OCN、RUNX-2）均有阳性表达，且HERS-DPCs（3D）组有明显的新骨生成（图4）。

图4  8周后通过HE染色、Masson染色及免疫组化染色评价牙槽骨种植情况

该研究基于挤出式3D生物打印利用GelMA重组HERS细胞和DPCs，并通过牙槽窝移植实验验证重组结构的成骨性能。研究结果表明GelMA具有优异的生物相容性，有利于细胞增殖、迁移等活动。3D打印的方式最大程度地模拟体内牙发育过程中的微环境，构建的HERS-DPCs共培养结构中，HERS细胞和DPCs发生迁移，植入SD大鼠牙槽窝缺损后有利于牙槽骨再生。该研究为牙源性上皮-间充质相互作用的研究提供了新策略。

文章来源：
http://doi.org/10.18063/ijb.v8i3.512