来源： EFL生物3D打印与生物制造
生物制造应用面临的主要挑战之一是如何获得能在可打印性、形状保真度、细胞活力和组织成熟度之间取得平衡的生物墨水。脱细胞方法可以提取天然细胞外基质，保留组织特异性基质蛋白。然而，骨骼脱细胞的关键挑战在于如何保留有机成分（胶原蛋白、蛋白聚糖）和无机成分（羟基磷灰石），以保持骨骼的天然成分和功能。此外，有必要研究脱细胞骨（DB）颗粒作为一种基于组织的添加剂在生物墨水配方中的作用，以开发功能性生物墨水。
来自土耳其伊兹密尔理工学院的Aylin Kara Özenler 团队与来自德国埃尔朗根-纽伦堡大学的Aldo R Boccaccini团队评估了在含有明胶（GEL）和前成骨细胞（MC3T3-E1）或人间充质干细胞（hTERT-MSCs）的生物墨水配方中加入不同大小（≤45 和 ≤100 μm）和浓度（1%、5%、10%（重量百分比））的脱细胞骨颗粒的效果。此外，本研究还提出了一种使用明胶、DB 颗粒和细胞的简易生物墨水配方，其制备过程简单，细胞存活率高。本研究对油墨的打印性能进行了评估。此外，还通过剪切稀化和触变性测试确定了流变特性。生物打印结构经过 28 天的培养。使用生化分析和荧光显微镜评估了细胞的活力、增殖和成骨分化能力。DB 颗粒的加入增强了细胞增殖和成骨分化能力，这可能是由于 DB 颗粒含有天然胶原蛋白和羟基磷灰石。使用 DB 粒子后，碱性磷酸酶活性显著增加，特别是在没有诱导细胞成骨的情况下。此外，荧光图像显示了细胞与材料之间明显的相互作用以及细胞在结构内部的附着。有了这些充满希望的结果，目前的简易生物墨水配方被认为是骨组织工程的潜在候选材料，它是一种可用于临床的材料，制备简单，细胞活性高。相关工作以题为“3D bioprinting of mouse pre-osteoblasts and human MSCs using bioinks consisting of gelatin and decellularized bone particles”的文章发表在2024年03月13日的国际知名期刊《Biofabrication》。
1. 创新型研究内容
本研究的目的是开发一种由凝胶、DB 颗粒和细胞组成的最小化生物墨水配方，并评估凝胶基质中不同大小和浓度的 DB 颗粒对细胞行为的影响。研究示意图如图 1 所示。在之前的研究中，发现 DB 粒子和 GEL 组合作为生物材料墨水对 MC3T3-E1 前成骨细胞有利。本研究用小鼠前成骨细胞（MC3T3-E1）和人端粒酶逆转录酶修饰的间充质干细胞（hTERT-MSCs）测试了 GEL/DB 复合生物墨水配方。在凝胶基质中加入了不同大小和浓度的 DB 粒子，以获得可打印的配方，同时增强细胞的行为。正如本研究之前所报道的，100 微米的颗粒大小会降低较高颗粒浓度下的可打印性，因此，本研究的假设是，减小颗粒大小可能会增加可打印性，而且细胞行为也会随着 DB 颗粒浓度的增加而增加。因此，本研究在两种不同细胞类型的生物墨水配方中评估了不同大小的 DB 粒子的效果。通过与 mTG 交联，3D生物打印结构的稳定性得以保持。在为期 28 天的培养过程中，对所有3D生物打印细胞负载 GEL/DB 构建物的细胞相容性、生物活性和成骨分化进行了评估。
图1 研究示意图
【流变特性】
本研究对 GEL 和 DB 嵌入式 GEL 生物材料油墨的流变特性进行了评估，以模拟与打印工艺相关的油墨流动条件。每组都进行了剪切稀化试验，通过将剪切速率从 0 s-1 增加到 100 s-1 来测量粘度。图 2A 显示，所有生物材料油墨的粘度都随着剪切速率的增加而降低，这表明所有材料都表现出适合挤压式 3D 打印的剪切稀化行为。在剪切速率为 10 s-1 时，GEL 的粘度被测定为 74 Pa.s，与加入 DB 粒子的组相比，差异具有统计学意义（图 2（B））。此外，添加不同大小和浓度的 DB 粒子也会影响粘度。经测定，GEL/1 DB（100 μm）、GEL/5 DB（100 μm）、GEL/5 DB（45 μm）和 GEL/10%DB （45 μm）的粘度分别为 91.70、111.61、123.84 和 170.67 Pa.s，在统计学上存在显著差异（图 2(B)）。与 100 μm 的 DB 颗粒相比，45 μm 的 DB 颗粒增加了油墨的粘度，其统计差异表明较小的颗粒尺寸增强了流变特性。值得注意的是，如图 2（B）所示，掺入 10% DB 颗粒的油墨粘度更高。这可能是由于油墨内部颗粒之间的相互作用。当复合油墨配方中的固体颗粒之间的相互作用被剪切力破坏时，就会出现剪切变稀的行为。油墨静止时的粘度较高，这是由悬浮颗粒之间的相互作用重新组织决定的，从而提供了形状稳定性。因此，较小尺寸的 DB 颗粒浓度越高，悬浮颗粒之间的相互作用就越密集，从而导致粘度越高。此外，在本研究团队之前的研究中，本研究发现较高的 DB 粒子浓度（>5%）会降低可打印性，而另一方面，高浓度的 DB 粒子有助于细胞生长。本研究发现较小尺寸的 DB 粒子在较高浓度下会增强流变特性，这也是本研究的假设之一。
图2 油墨和 3D 打印水凝胶的流变特性及打印性能评估
【3D 打印 GEL/DB 支架】
本研究对 GEL 和 GEL/DB 油墨的可打印性进行了评估。光镜图像显示了用转谷氨酰胺酶交联后不同大小和浓度的3D打印 GEL 和 GEL/DB 水凝胶（图 2(D)）。水凝胶被制成圆柱形，具有交替的 0°/90°支杆结构，从而在支杆之间形成方形大孔。3D打印的 GEL 和 GEL/DB 水凝胶显示出具有方形孔几何形状的良好打印结构（图 2(D)）。所有墨水都很容易打印，特别是较小尺寸（45 微米）、较高浓度的 DB 粒子有利于打印，这可能是均匀分布在 GEL 基质中的悬浮较小 DB 粒子之间相互作用的结果。尽管纯 GEL 水凝胶具有透明度，但颗粒浓度越高，GEL/DB 水凝胶的浊度越高（图 2(D)）。所有组的打印适性因子（Pr）都是通过公式（1）计算得出的。Pr < 1 表示油墨凝胶不足，孔角呈圆形；Pr = 1 表示凝胶适当，孔几何形状呈理想的方形；而 Pr > 1 则表示油墨过度凝胶。所有组的 Pr 因子都接近 1。含有 5%DB 的 GEL 组显示出较低 Pr 因子（Pr = 0.9 ± 0.04）的圆形孔几何形状，与纯 GEL 水凝胶相比，本研究发现了统计差异（图 2（E））。根据之前的报道，当 Pr 因子在 0.9 和 1.1 之间时，3D打印水凝胶会显示出适当的股形态。因此，5% 的 DB 粒子（100 微米大小）会降低3D打印性能，而 5%的 DB 粒子（45 微米大小）则显示出最佳打印性能。此外，5% 的 DB 粒子（粒径为 45 微米）的 Pr 系数为 0.9，具有足够的打印能力和形状保真度。与纯 GEL 组相比，将颗粒尺寸减小到 45 微米可提高 5% DB 组的可打印性，但在统计上没有差异。
【生物打印的 MC3T3-E1 前成骨细胞负载 GEL/DB 构建物】
本研究成功制作了负载 1% GEL/DB 构建物的 MC3T3-E1 前成骨细胞，并在细胞培养期间用光学显微镜观察了细胞在构建物内的分布和定位情况。图 3 显示了 GEL 和 GEL/DB 结构以及 TCP（组织培养聚苯乙烯）对照组内部的细胞光镜图像。在生物打印之前，制备了含有 MC3T3-E1 的2D铸造 GEL 和 GEL/DB 水凝胶，以观察水凝胶中的细胞。由于 GEL 水凝胶是完全透明的，因此不易分辨水凝胶的边缘。如图 3(A)所示，GEL 和 GEL/DB 水凝胶中的细胞都是可见的，7 d 后可观察到附着和伸长的细胞（图 3(A)）。此外，还观察到细胞附着在 GEL/DB 水凝胶中的 DB 颗粒上（图 3（A））。在3D生物打印样品中，MC3T3-E1 细胞分布在 GEL 和 GEL/1% DB 构建物中，并且在细胞培养期间不断增殖（图 3(B)）。此外，如图 3（C）中的放大图片所示，14 天后，细胞迁移到结构表面，并完全覆盖了3D生物打印结构。GEL水凝胶在 14 天后会降解，并开始在细胞培养基中失重，这在之前的报道中已有提及。由于 GEL 开始降解，细胞可以在 3D 打印的结构中找到空间并在结构中迁移。在培养期间，随着结构的降解和细胞的增殖，细胞迁移到结构外，并在细胞培养板上观察到细胞，如放大图像所示（图 3(C)）。此外，GEL 的特定 RGD 序列允许细胞在整个培养期间粘附和增殖，这证明了 GEL 和 GEL/DB 生物墨水配方的细胞相容性。
图3 充满细胞的2D铸模和3D生物打印结构的光学显微镜图像
在3D生物制造结构中，保持细胞活力和3D打印结构的形状保真度或稳定性是一个重要的关键因素。因此，在培养期间对3D生物打印结构中的 MC3T3-E1 细胞进行活/死染色后，对其存活率进行了观察。荧光显微镜图像显示了活细胞（绿色）、死细胞（红色）和细胞核（蓝色）（图 4）。DB 颗粒也因其自发荧光而显示为蓝色/绿色。图像显示，MC3T3-E1 细胞在第 7 天时附着在 GEL 和 GEL/DB 构建物内并保持活力（图 4(A)）。14 天后，细胞在结构中附着和扩散得更多，只观察到少量死细胞（图 4(A)）。培养 14 d 后，DAPI 染色显示细胞核密集。此外，2D细胞负载 GEL 和 GEL/DB 水凝胶中的 MC3T3-E1 细胞在第 14 天仍保持活力（图 4(B)）。活/死染色结果证实，GEL 和 GEL/DB 墨水配方具有细胞相容性，不会损害 MC3T3-E1 细胞的活力。
图4 MC3T3-E1 细胞的活/死染色结果
在 28 天的培养期内，用 LDH 细胞毒性检测法评估了油墨可能产生的细胞毒性效应。在2D细胞培养中，细胞释放的细胞外 LDH 水平相似，在 28 天的培养期内没有发现统计差异（图 5(A)）。然而，3D生物打印组在第 1 天的 LDH 水平明显更高（图 5(A)）。早期 LDH 水平较高的原因可能是3D生物打印过程中剪切力导致细胞死亡。在随后的培养天数中，细胞外 LDH 水平持续下降，并具有统计学意义，这表明剩余细胞在后期培养中存活并增殖。MC3T3-E1 细胞的存活率是根据 WST-8 法测定的细胞代谢活性进行量化的，数据显示，在整个培养过程中，各组细胞的存活率都在逐渐增加（图5(B)）。此外，3D生物打印 GEL 和 GEL/DB 结构的细胞存活率较高，与2D浇铸组相比有显著的统计学差异。此外，与其他组相比，3D生物打印 GEL/DB 结构中的细胞存活率最高（图 5(B)）。
【细胞增殖和形态】
根据 PicoGreen 检测法对dsDNA 的定量分析，本研究评估了生物打印结构内部的细胞增殖情况。与根据代谢活性得出的存活率结果（图 5(B)）一致，生物打印结构内部的细胞数量在细胞培养期间逐渐增加（图 5(C)）。第一天，生物打印结构中的细胞数量低于2D浇注水凝胶中的细胞数量，这可能是图 5（A）所示第一天释放的 LDH 较高的结果。第一天之后，2D浇注水凝胶组的细胞数量在第 7 天有所增加，然后在整个培养期间保持稳定。另一方面，3D生物打印结构中的细胞在 28 天内继续增殖，与2D水凝胶相比，在第 7 天、14 天和 28 天发现了显著的统计学差异。此外，在第 21 天，生物打印 GEL/DB 构建物中的细胞数量最多，与3D打印 GEL 组相比，差异有统计学意义（图 5(C)）。根据细胞毒性、存活率和增殖调查，GEL 和 DB 加入 GEL 的生物墨水为生物打印后的细胞生长提供了3D微环境，作为一种基于天然的最小化生物墨水配方，显示出良好的效果。
本研究利用荧光显微镜评估了3D生物打印结构和2D浇注水凝胶内的细胞粘附性和细胞形态。DAPI 和 F-Actin 染色分别显示 MC3T3-E1 细胞的细胞核（蓝色）和细胞骨架（绿色）。显微镜图像显示了2D铸造和3D生物打印结构的细胞粘附情况，以及培养 28 天后细胞与材料的相互作用（图 5(D)）。2D浇铸组在第 28 天显示了细胞与材料的相互作用，细胞覆盖了 DB 嵌入 GEL 水凝胶内的 DB 颗粒表面（图 5(D)）。在3D生物打印 GEL/DB 组中，细胞覆盖了结构，显示出与 DB 粒子非常积极的相互作用，此外，细胞在第 28 天覆盖了孔区域，这可以从放大图像中看到（图 5(D)）。
图5 细胞在 GEL 和 GEL/DB 构建物内生长
【评估不同大小和浓度的 DB 粒子对负载 hTERT-间充质干细胞的3D生物打印 GEL/DB 构建物的细胞行为的影响】
本研究对3D生物打印结构内的细胞存活率通过活/死染色进行了评估。荧光显微镜图像显示，在 28 天的培养期间，细胞在 GEL 和 GEL/DB 构建物内存活和生长（图 6）。此外，由于胶原纤维的自发荧光，DB 颗粒显示出蓝色。第一天，在所有组中都观察到大量存活细胞（绿色），并检测到细胞集群，特别是在 DB 结合的结构中。由于颗粒密度高且具有自发荧光，hTERT-间充质干细胞在第一天并不清晰可见。然而，大面积的绿色染色，尤其是在 10%的 DB 组中，表明结构内形成了细胞簇（图 6）。7 天后，细胞开始在生物打印结构中伸长和扩散，之后细胞在 28 天的培养期内保持活力并不断增殖。hTERT 间充质干细胞的扩散良好，培养 28 d 后观察到细胞完全覆盖。此外，活细胞的密度在所有培养日都很高。即使在第 28 天也很难发现死细胞（红色），这表明油墨配方具有细胞相容性，较高的 DB 粒子浓度有助于细胞生长。
图6 3D生物打印 GEL 和 GEL/DB 复合结构中 hTERT-MSC 细胞第 14 天的活/死染色结果
生物打印后，使用 LDH 细胞毒性检测法对墨水材料的潜在细胞毒性进行量化。将含有细胞的结构培养 28 天，在每个时间点对细胞培养上清液中的细胞外 LDH 释放量进行量化。结果显示，在整个培养过程中，各组的 LDH 水平都保持稳定，没有增加。各时间点和各组之间没有发现统计学差异，这表明含有 GEL 成分的 DB 对 hTERT-间充质干细胞没有细胞毒性作用（图 7(A)）。正如在 GEL 构建物中加入兔 DB 粒子（图 4 和图 5）所显示的那样，牛 DB 粒子对 hTERT-MSC 也没有细胞毒性作用。
图7 生物打印 GEL/DB 构建物内 hTERT-MSC 细胞的生物活性
本研究利用共聚焦显微镜详细评估了3D生物打印结构内部的细胞形态和细胞附着情况。细胞核（蓝色）和细胞骨架（绿色）分别采用 DAPI 和 F-Actin 染色（图 8）。此外，由于 DB 颗粒中纤维胶原的自发荧光，结构内部的 DB 颗粒也清晰可见（呈红色/粉红色）。图像显示，细胞在第 28 天时在3D生物打印结构内部生长和增殖（图 8）。细胞在 GEL 和 GEL/DB 构建物内附着并伸长，所有组中都能看到细胞覆盖的趋势。值得注意的是，在含有 10% DB 的 GEL 构建物中观察到了更大的细胞网络以及与 DB 颗粒的良好互动。这种细胞粘附性表明，细胞与 GEL/DB 组中均匀分布的 DB 颗粒进行了理想的相互作用。
图8 3D生物打印 GEL 和 GEL/DB 构建物内生长的 hTERT 间充质干细胞在培养第 28 天时的共聚焦显微镜图像
2. 总结与展望
本研究展示了一种由 GEL、DB 颗粒和 MC3T3-E1 前成骨细胞或 hTERT-MSCs组成的最小化生物墨水配方。本研究的主要方法是利用骨组织的天然 ECM 成分，并确定颗粒的理想浓度，以获得更好的细胞反应。本研究中使用的 DB 颗粒不仅含有胶原纤维，还含有羟基磷灰石，而现有研究同时使用了脱细胞和脱矿物质过程，这导致骨的生物矿化特性被削弱。此外，本研究还提出了基于 GEL 的 mTG 交联（一种已获 FDA 批准的材料）简约生物墨水配方，与使用多种改性剂或化学成分的复杂水凝胶系统相比，这种配方可以直接制备，而这些改性剂或化学成分可能会产生细胞毒性，也无法用于临床。
文章来源：
https://iopscience.iop.org/article/10.1088/1758-5090/ad2c98
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