如何利用3D打印技术制备载细胞复合水凝胶体系促进骨软骨再生

来源： EngineeringForLife

随着老龄化人口和运动损伤率的上升，骨软骨 (OC) 缺损正成为一个严重的全球健康问题，组织工程植入物为缺损区域提供机械支撑，并作为生物活性因子载体招募原位细胞或重塑局部不利微环境，提示了 OC 再生的潜在替代方法。

本期，EFL以发表在杂志《The Innovation》的“3D-bioprinted anisotropic bicellular living hydrogels boost osteochondral regeneration via reconstruction of cartilage–bone interface”研究为例，解析如何利用由甲基丙烯酰化明胶（GelMA） 和甲基丙烯酰化海藻酸盐 (AlgMA) 制成的复合水凝胶作为生物墨水，精确打印同时将关节软骨祖细胞 (ACPC) 和骨髓间充质干细胞 (BMSC) 嵌入分层中的各向异性双细胞活水凝胶 (ABLH)，促进骨软骨再生。   

为什么选择ABLH

甲基丙烯酰化明胶（GelMA）具有出色的打印能力和快速的光交联特点，可提高生物打印的可行性。基于GelMA 出色的生物相容性和 AlgMA 的易操作性，该研究通过双通道挤出生物3D打印技术制造了由 GelMA 和AlgMA组成的各向异性双细胞活水凝胶 (ABLH)。可将软骨来源的ACPC和骨髓来源的 BMSC分配到 ABLH 的分层中，保持了高细胞活力。此外，与均质水凝胶相比，ABLH 中的新软骨和软骨下骨同步再生率更高，能够调节的软骨-骨-血管串扰，实现更好的软骨-骨界面。

如何制备ABLH

（1）GelMA和AlgMA的合成及生物墨水制备：将类型A猪皮明胶或海藻酸钠分别溶解在50°C的PBS中，然后分别加入甲基丙烯酸酐进行反应。之后，将溶液稀释并在40°C下用蒸馏水透析3天，冷冻干燥3天。在使用前分别进行2小时的紫外线灭菌，随后将GelMA溶解在37°C的PBS中，加入光引发剂和AlgMA，搅拌均匀，并加入悬浮细胞，制备成生物墨水。（EFL可提供系列GelMA和AlgMA水凝胶产品，详询文末区域销售）

（2）ABLHs的生物打印：使用3D生物打印机进行生物打印，在室温下以70 kPa的压力挤出不同比例的生物墨水，逐渐增加挤出压力直到线条顺利挤出或达到最大70 kPa，针头尺寸为0.3 mm，线条间距设为0.5 mm。（EFL可提供系列挤出式生物3D打印机，点击链接，查看详情）

ABLH的优势和作用

（1）ABLH具有较好的物理机械性能和生物相容性
当 GelMA 和 AlgMA 混合时，复合生物墨水保持有效的剪切稀化行为和温度相关模量，能够快速交联。在室温下以细胞友好的挤出压力直接打印，并在光交联后保持构建体的稳定结构。此外，ABLH具有较好的生物相容性，适用于 OC 再生，其中7G3A 是进一步研究的最佳比例。其上方为 ACPC（3 毫米高），下方为 BMSC（5 毫米高）（图1）。

图1 复合生物墨水的制备和可打印性

（2）ABLH 的体外异质谱系分化
分别从兔软骨和骨髓中分离的软骨祖细胞 ACPC 和骨祖细胞 BMSC 在体外单层培养中进行表征和比较。两种细胞形态相似，然而，BMSC 的克隆形成和增殖能力比 ACPC 强。随后，使用 3D 生物打印制备了 ACPC 或 BMSC 负载水凝胶，由于在生理温度下可打印的优势，生物打印水凝胶促进了内部细胞的存活、增殖和扩散。在体外双层模型中可见，水凝胶一层为无细胞层，另一层包裹细胞，ACPCs 和 BMSCs 分别在 7 或 14 天内扩散（图2）。

图2 复合生物打印水凝胶支持嵌入细胞的存活和增殖

为了进一步评估两种细胞类型在早期或晚期的定向分化的潜力，将含有 ACPC 或 BMSC 的水凝胶分别暴露于软骨或成骨培养基中进行 7 或 14 天的诱导。软骨特异性基因（Col2a1、Acan 和 Sox9）的表达水平在体外分化过程中逐渐增加。番红 O 染色显示，在含有 ACPC 的水凝胶中，C-ECM 逐渐改善，免疫组织化学染色显示COLII和ACAN 的表达在 3D 培养平台中显著增加。差异表达基因的热图显示，软骨形成正调控基因的表达水平增加，但负调控基因的表达水平受到抑制。深入的通路分析表明，激活的线粒体 ATP 合成和氧化磷酸化与 ACPC 向软骨细胞谱系分化有关。骨特异性标志物的表达水平在 BMSC 负载水凝胶中上调，茜素红染色可见O-ECM逐渐增强。热图显示成骨正调控基因Gli3、Ddr2 和 Bmp2/4/7 26 的表达水平显著增加，同时负调控基因Mdk、Hdac7和Grem1的表达被抑制。除此之外，在 BMSC 分化为成骨细胞谱系时还发现了昼夜节律信号传导。综上所述，ABLH 在体外 3D 培养中分别促进了 ACPC 或 BMSC 的成软骨和成骨分化（图3）。  

图3 负载ACPC 或 BMSC 的生物打印结构对软骨形成或成骨的影响

（3）ABLH 促进体内软骨修复
为了探索 ABLH 在软骨或骨再生方面的潜在治疗益处，在兔股骨滑车沟中建立了全层 OC 缺损模型。根据术后 6 周的大体和组织形态学图像，缺损组中软骨修复仅发生在主要由纤维结缔组织组成的 C-ECM 稀少的表面。无细胞水凝胶表现出脆弱的软骨连接和空洞骨结构，相比之下，三种载细胞水凝胶表现出相对完整的 OC 单元，形成了软骨基质丰富的区域，ABLH 有助于位于软骨和软骨下骨上部的 C-ECM合成，此外，手术后 12 周，除缺损组的 OC 单元不完整外，四个水凝胶治疗组的形态重建均已完成，其中BMSC 水凝胶比 ACPC 水凝胶显示出更完整的软骨下骨结构，ABLH 的软骨再生效率比 ACPC 水凝胶高 23.5%，总的来说，这些发现表明 ABLH 促进软骨的修复和更新。

图4 ABLH 促进体内软骨再生

（4）ABLH 促进体内骨重塑
通过微型计算机断层扫描分析和组织学观察详细检查了 ABLH 对骨重建的潜在治疗效果。植入后 6 周，与缺损组相比，无细胞水凝胶对骨量改善的作用有限，表明仅靠机械支撑不足以推动新骨形成，ACPC 水凝胶倾向于在表面形成纤维组织状连接，在深层留下囊腔，不仅诱导下层骨重建，还保持上软骨层的完整性，提供合适的软骨和骨发育环境。成熟骨和COLI 的特异性染色显示，双细胞水凝胶实现了仿生骨再生，具有高度自然的微观结构，与含有 BMSC 的水凝胶相比，骨结构成熟度高出 20.8%（图5）。   

图5 ABLH 加速了体内软骨下骨的形成和重塑

（5）ABLH 协调软骨-骨-血管串扰以进行 OC 单元重建
在体外软骨生成的过程中，携带ACPC的水凝胶中血管生成逐渐减弱，基因集富集分析（GSEA）进一步证实了血管生成的抑制作用。基于基因本体论（GO）的热图显示，早期的软骨生成过程中有新血管形成，但在软骨成熟和分化结束后，这些血管的生成明显减少。在体外成骨过程中，携带BMSC的水凝胶中血管生成逐渐增加，GSEA分析证实了在分化过程中血管的逐步形成，GO分析表明，血管生成、重塑和新血管的扩张对于成骨过程中骨基质的重塑必不可少。体内实验中，通过免疫荧光染色可见，BMSC水凝胶更倾向于促进骨生成，而含有ACPC的水凝胶更有利于软骨生成。在骨关节炎的进展过程中，软骨下骨区的H型血管数量增加，甚至侵入软骨组织，通过抑制H型血管的形成，可以平衡软骨代谢并减轻骨关节炎的症状。在双细胞水凝胶中，H 型血管被限制在骨层中，而不会穿透和扰乱软骨稳态，对于获得更和谐的软骨-骨界面至关重要。总之，ABLH 重新配置了成骨细胞-软骨细胞相互作用，以实现分层 OC 单元重建（图6）。   

图6 ABLH 协调软骨-骨-血管串扰以重建 OC 单元

总结

该研究构建了负载细胞的ABLH，可在室温下直接打印，保持了细胞生长和分化的能力。在体外3D培养系统中，ACPC可分化为软骨细胞，BMSC可分化为成骨细胞。原位植入的ABLH在体内OC缺陷模型中实现了上层软骨细胞外基质（C-ECM）和下层骨细胞外基质（O-ECM）的特异性重建。从机制上看，ABLH通过时空调控软骨-骨-血管的相互作用，促进了仿生OC单元的重塑。该研究提出了一种利用活细胞的双层水凝胶生物适应性策略，为高效修复OC缺陷提供了一种全新的方法。

文献来源：
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC10746383/