徐铭恩主任：3D打印肝组织单元在药物筛选中的作用

在第一届Regenovo生物3D打印学术论坛上，浙江省医学信息与生物三维打印重点实验室主任徐铭恩教授做了题为“3D打印肝组织单元在药物筛选中的作用”的演讲。在演讲中，徐教授介绍了他们在打印肝组织单元中遇到的一些问题和在药物筛选研究中所做的工作。

浙江省医学信息与生物三维打印重点实验室主任

徐铭恩教授

肝脏是人体药物代谢的主要器官，通过研究药物在肝脏中的代谢机制，可以帮助我们筛选针对某些疾病的药物。而通过3D生物打印技术打印出的肝组织，可以代替实验动物或器官，应用于我们的药物筛选中。

肝组织单元与3D打印

肝脏是由大概50-100万的肝小叶结构组成的。因此，我们的设想是，如果能够在体外把肝小叶结构设计好打印出来，并且使它具有功能，就能够像集成电路一样把它们集成起来，最后变成一个肝脏。因此，我们的关注点是在怎样构建肝小叶的层次上的。

肝小叶有很多特殊的结构，如中央静脉、肝板、肝血窦等。除了细胞本身的表型以外，这些结构对于最后功能的实现也会有影响，这也是3D打印的特长所在，因此我们通过增加表面积、增加内部液体的湍流等，研究了这些结构对肝脏的影响。

组织的打印与细胞的培养

首先我们打印了如正方形、三角形等不同结构的组织，在这些组织中，细胞会不停地复制分裂，然后形成一个一个的微球。这个微球会进一步发展，到第13天的时候，这些微球之间会发生连接并融合。长到30天的时候，组织内部会形成一些典型结构，一个就是支架完全被打印进去的肝脏细胞所替代，除了替代掉的之外，还有一些材料没有降解掉的，在这部分材料中也有一些细胞团的存在。因为内部出现了低氧的环境，所以组织里面自发地出现了非常多的类似血管的通道，保证了内部养分的供应。

通过激光共聚焦的方式，我们可以观察内部细胞的存活情况。从13天的数据来看，存活率是比较高的，而之后存活率也一直保持了一个比较高的状态。

打印过程中的质量控制

在培养出了具有结构基础的组织以后，我们在研究功能的时候发现，功能的标准偏差非常大。这到底是因为细胞功能、打印处理或者诱导的问题，还是本身结构的问题呢？

结构问题是我们在细胞表型后需要考虑的，因为水凝胶是非常软的一种材料，在打印过程中，就有较大的形变。我们建立了一套复合合多种成像技术和处理算法的系统，对打印结构进行一个深度检测和分析。在整个过程中我们发现，其实打印过程已经出现了非常多的问题，比如材料形变以及交联过程中控制的不准确等。

在此基础上，我们建立了一系列的算法，对材料的孔径、连通率、表面积等因素做了定量化的分析。利用这些算法我们可以做一个质控，使得打印的结构更为精准地符合我们的设计。虽然生物本来就是非线性的，但是我们发现，对于结构的控制是线性相关的，这意味着我们可以对整个过程进行精准的反馈控制。相比之下，如果没有基于这套量化分析的算法，不做控制打印出来的结构的差异性是非常大的，而结构的不同直接带来了细胞生物活性的不一样。

检测细胞增殖

在排除掉结构以及增殖过程对结构的破坏因素之后，我们对细胞的增殖情况做了检测。

细胞的增殖开始有个快速的增长过程，接着会进入一个相对缓慢的增长过程。大概在17-22天以后，细胞增殖进入了一个相对平台期，此时我们可以检测它们的一些基本因素。比如白蛋白，而白蛋白的分泌在8周的时间里一直维持在一个比较平稳的分泌水平。当然，P450酶系、CYP3A4基因的表达等，也都是我们关注的点。

从整体上来看，跟平面培养的数据相比，3D打印之后的细胞内一些P450酶系基因的表达不但没有增加，反而开始降低了，特别是到2-3天的时候达到一个低值。在排除掉打印过程中压力和剪切力等导致了细胞表型发生变化等这些因素后，我们发现主要的原因应该是长时间平面培养的这些细胞在重新回到3D的环境下，本身就有一个适应期。

药物试验

过了66个小时之后，细胞增殖的数量就开始上升，大概20天以后，我们用利福平这一典型的用来做肝损的阳性药物的实验。

我们设置了平面对照，发现差异非常大，不管这种差异是不是更接近于人体真实情况，差异的存在本身就意味着平面和3D之间存在区别，说明这个研究是有价值的。

比如说我们这里利福平它明显地呈现对肝功能更为长时间的影响。首先是三维条件下CYP3A4的表达相比平面的表达时间更长。第二在利福平的作用下会有一些长期的毒性显示出来。

围绕利福平，我们又做了一系列的数据，包括从CYP2B6，MRP2，BSEP等一系列跟肝脏药物代谢相关的基因表达，跟平面之间都存在显著差异。还有苯巴比妥、奥美拉唑等几个典型的阳性药物，在这样的模型中相比传统的平面是有区别的。

在这个基础上，我们尝试开发高通量筛选技术。高通量筛选需要基于在线即时检测的技术。我们建立了包含多个叉指电极阵列的芯片，它依靠的是细胞跟电极之间接触的阻抗来在线检测细胞的增殖、迁移和死亡情况。

打印之后有几个问题要解决。这种电极的设计是针对培养在平面的细胞，而现在细胞跟材料混在一起，我们需要确认在这种情况下能否测到它的增殖和死亡情况。

我们做了一系列的测试，包括加不同的溶液，检测频率等条件，看它对细胞的信号的检测有没有影响。我们用传统的Alamar bule实验和细胞芯片的方式检测过组织的增殖过程，在线性上是基本一致的。

肿瘤药物筛选所希望的结果是，筛选出的药物能够最大程度杀死肿瘤细胞同时对正常细胞的损伤最小。我们把肝脏组织和和肿瘤组织打印在一块芯片上，从阳性药物检测来看，这个模型可以进行精准筛选。

同时我们也发现，一些需要肝脏二次代谢物才有很强的抗肿瘤毒性的药物，在这个模型中也能被筛选出来。

我们今后想做的一些工作是，比如通过集成将多种组织在一块芯片上，然后加上肝脏看他们之间的反应。

最后做一个总结，首先我觉得3D打印这个技术在个性化需求强烈的生物医学领域有很大的应用价值，对于科学研究来说它是一个很好的工具。特别是这个工具可以有可控结构的材料以及可以把细胞打印成特殊的结构。无论为组织工程也好，药物的精准化筛选、个性化给药也好，都是提供了一种全新的可能,请关注南极熊3d打印网。


来源：火石创造
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