使用基于微孔光交联脱细胞软骨基质的生物墨水进行耳廓软骨的生物打印和再生

来源：生物打印与再生工程


组织工程为耳廓重建提供了一种有前景的策略。尽管基于聚合物支架实现了组织工程耳廓重建的第一个国际临床突破，但由于其临床疗效不理想，该方法尚未被认为是临床可用的治疗方法。这主要是因为重建结构容易引起炎症和变形。

近期中国医学科学院整形外科医院蒋海越教授团队联合院外单位团队在Bioactive Materials在线发表了题为“Bioprinting and regeneration of auricular cartilage using a bioactive bioink based on microporous photocrosslinkable acellular cartilage matrix”的研究论文。在这项研究中，该团队提出了一种通过集成多喷嘴生物打印，在甲基丙烯酸明胶 (GelMA)、聚环氧乙烷 (PEO) 和聚己内酯 (PCL) 的帮助下，使用耳廓软骨细胞和基于仿生微孔甲基丙烯酸酯修饰的无细胞软骨基质 (ACMMA) 的生物活性生物墨水技术，开发具有精确形状、低免疫原性和优良力学的生物耳廓等效物的新方法。可光交联的 ACMMA 用于模拟软骨特异性微环境的复杂性，以实现活跃的细胞行为，GelMA、PEO 和 PCL 用于平衡可打印性和物理特性以实现精确的结构稳定性，并且形成微孔结构以实现畅通无阻的营养交换，为更高的形状保真度提供机械支撑。最后，在体内成功再生出形态保真度高、弹性好、软骨腔丰富、软骨特异性ECM沉积丰富的成熟耳廓软骨样组织，为患者特异性耳廓软骨的制备和再生提供了新的机会和新的方法。

图1 全文图形概要。

实验方法及结果
1. 脱细胞软骨基质 (ACM) 的制备
在无菌条件下从巴马小型猪中分离出耳软骨。去除皮肤后，将剩余的耳软骨组织切成小块。使用预冷的无菌去离子水冲洗获得的软骨片，并使用自动样品冷冻研磨机研磨成粉末。软骨粉依次用 0.5%胰蛋白酶/磷酸盐缓冲盐水 (PBS)、核酸酶溶液（在 10 mM Tris-HCl，pH = 7.5 中含有 50 U/ml 脱氧核糖核酸酶和 1 U/ml 核糖核酸酶 A）、10 mM Tris- HCl（包括 10 U/ml 抑肽酶）和 1% Triton X-100/PBS 溶液用于脱细胞。在冷冻干燥过程之后，10将mg/ml的脱细胞软骨粉末在2mg/ml的胶原酶溶液中在室温下酶解24小时，同时持续搅拌以形成可流动的粘性溶液。将粘性溶液终止并用 3,500 D 透析膜在去离子水中透析 72 小时。最后将制备好的ACM冻干，-20℃保存备用。

图2. 脱细胞软骨基质的制备和蛋白质组学分析。

A) 通过脱细胞和酶解程序制备ACM。B) DNA 含量、GAG含量和胶原蛋白含量的定量分析。

2. 脱细胞软骨基质的甲基丙烯酸化和具有微孔结构的ACMMA基水凝胶的制备
为了制备可光交联的水凝胶，ACM 被甲基丙烯酸酐 (MA) 改性。简而言之，将 0.5 g 水溶性ACM  溶解在去离子水中，并在冰浴中以 0.5 mL/min 的速率加入 0.5 mL MA。用 5 M NaOH 将 pH 值保持在 8 和 10 之间，并在不断搅拌下继续反应过夜。反应后，用1M HCl中和溶液，用3,500D透析膜在蒸馏水中透析1周，然后冷冻和冻干。

在细胞载入前12小时制备预凝胶溶液。冻干的 ACMMA和GelMA都完全溶解在培养基中，分别达到5%的最终ACMMA和GelMA 浓度。光引发剂LAP粉末完全溶解在溶液中，最终 LAP浓度为0.25%。将成孔剂PEO（平均 Mw = 300,000）粉末溶解在溶液中，使PEO的最终浓度达到1%。基于相分离空隙形成策略，采用ACMMA/GelMA和PEO聚合物的两种生物相容性溶液的水性两相乳液在随后的光交联和浸出过程中制备微孔水凝胶。所有水凝胶制剂在连续搅拌下充分混合，用注射器过滤器（0.45 μm孔径）消毒，并保存在培养箱中避光。最后，通过暴露于蓝光（波长：405 nm；强度：20 mW/cm2；距离：10 cm；曝光时间：60 s）诱导水凝胶交联。

图3. 甲基丙烯酸化脱细胞软骨基质水凝胶的甲基丙烯酸化机理和光交联过程。

A)GELMA 和 ACMMA 的甲基丙烯酸化机理，以及在蓝光照射 (405 nm, 20 mW/cm 2 ) 下从可流动的预凝胶溶液到固化水凝胶的光交联机理。B) GelMA、ACMMA 的1 H NMR 光谱和 ACMMA/GelMA 凝胶前体的光交联过程（红色箭头表示甲基丙烯酰胺基团的信号峰在 5.4 和 5.6 ppm）。C) 基于 ACMMA 生物墨水的格子状结构的光交联过程和生物打印过程。

3.微孔水凝胶的理化性质
   

图4. 微孔水凝胶的物理化学性质。

A)打印通过溶解PEO的微孔水凝胶的示意图说明对细胞行为有益。B)示意图和光学图像，罗丹明 B（与罗丹明 B 结合的水凝胶网络发出红色荧光，而深色区域表示微孔），以及与无孔水凝胶相比显示微孔结构的 H&E。生物墨水的流变特性：C) 储能模量 (Gʹ) 和损耗模量 (Gʹʹ)，D) 凝胶时间，E) 剪切模量，F) 粘度性能，以及 G) 温度敏感特性。 H) 酶介导的生物墨水降解。

4. 微孔生物墨水的生物相容性分析

图5. 微孔生物墨水的生物相容性分析。

A) Calcein-AM 染色测试的细胞迁移示意图（绿色箭头表示细胞迁移）。B) 活死染色 (绿色荧光和红色荧光分别代表活细胞和死细胞) 和 C) 细胞活力和细胞负载构建体中软骨细胞 DNA 含量的量化。D) Ki67 的免疫荧光（绿色荧光表示增殖细胞，黄色箭头表示正在分裂的细胞）和 E) 细胞周期分析以评估细胞增殖。

5. 生物打印网格状细胞负载结构进行体内软骨再生

图6. 使用生物打印格子状细胞负载结构进行体内软骨再生。

A) 4 周、B) 8 周和 C) 12 周的体内培养后工程软骨样组织的 H&E、番红-O、阿尔新蓝和胶原 II 染色的大体视图和组织学染色。D)体内培养 4 周、8 周和 12 周后再生软骨样组织的GAG含量、胶原蛋白含量、DNA 含量、GAG/DNA、胶原蛋白/DNA 和杨氏模量的生化和生物力学定量评估（n = 5)。红色箭头：细胞或分泌的 ECM。绿色箭头：残留的水凝胶材料。黑色箭头：微孔结构。

6. 使用基于 ACMMA 的微孔生物墨水进行耳廓软骨的生物打印和再生

图7. 使用基于 ACMMA 的微孔生物墨水进行耳廓软骨的生物打印和再生。

A) 基于 ACMMA 微孔生物墨水的人体耳廓和生物打印耳廓构造的 3D 数字模型。B) 生物打印耳廓结构的活/死染色。C) 在裸鼠中培养 12 和 24 周后再生耳廓软骨。D)再生耳廓软骨的3D重建和3D偏差比较。E)在体内培养 24 周后，再生耳廓软骨的 H&E、番红-O、阿尔新蓝和胶原蛋白 II 染色。

7. 使用基于 ACMMA 的微孔生物墨水和 PCL 支持进行耳廓软骨的生物打印和再生

图8. 使用基于 ACMMA 的微孔生物墨水和 PCL 支持进行耳廓软骨的生物打印和再生。

A) 基于 ACMMA 微孔生物墨水和 PCL 的人体耳廓和生物打印耳廓等效物的 3D 数字模型。B) 生物打印耳廓结构的活/死染色。C) 在裸鼠中培养 12 和 24 周后再生耳廓软骨。D)再生耳廓软骨的3D重建和3D偏差比较。E)在体内培养 24 周后，再生耳廓软骨的 H&E、番红-O、阿尔新蓝和胶原蛋白 II 染色。

8. 再生耳廓软骨的定量分析

图9. 再生耳廓软骨的定量分析。

再生耳廓软骨的形状保真度在 A) ± 1 mm 和 B) ± 2 mm 的偏差范围内。C) 工程软骨面积的量化。D) GAG含量、E) 胶原含量、F) DNA 含量、G) 应力-应变曲线和 H)再生耳廓软骨的杨氏模量的生化和生物力学评估。

PCL的引入显着提高了耳廓结构的形状保真度（图9 A和B），但唯一的不足是缓慢降解的PCL的空间占用影响了工程软骨的形成和整合（图9 C）。与组织学结果一致，定量分析（图 9 D-F）显示，无论是否有 PCL 支持，再生耳廓软骨的胶原蛋白含量均达到原生软骨的 85% 以上（* p  < 0.05），而 GAG 含量和DNA含量几乎达到天然软骨水平，无统计学意义的差异（ p  ＞ 0.05）。同时，生物力学性能表明，没有PCL支持的再生耳廓软骨的模量达到原生软骨的65%以上，而有PCL支持的再生耳廓软骨的模量达到了原生软骨的2.6倍左右（* p  < 0.05） （图 9 G 和 H）。这些结果表明，PCL的存在虽然存在空间占用问题，但在提供足够强度和刚度支撑的同时，并不影响生物墨水区域成熟软骨组织的形成。

总结
综上，该团队开发了一种基于软骨脱细胞基质的光敏多孔仿生生物墨水，使用多喷头3D打印技术，能够制造具有精确形状、低免疫原性和优良力学性能的耳廓仿生结构，为个性化耳廓形态软骨的制备和再生提供了新的材料和新的方法。


参考文献
Bioprinting and regeneration of auricular cartilage using a bioactive bioink based on microporous photocrosslinkable acellular cartilage matrix, Bioactive Materials 16 (2022) 66–81.
原文链接：https://doi.org/10.1016/j.bioactmat.2022.02.03