甲壳素纳米原纤维辅助3D打印全甲壳素水凝胶用于伤口敷料

来源：EngineeringForLife

3D打印技术中使用的直接墨水书写技术通常应用于生物医学水凝胶的设计。近期，武汉科技大学的段博团队提出了一种通过直接墨水书写技术制备用于伤口敷料的全甲壳素墨水的策略（图1）。打印的支架显示出均匀的微米级孔隙结构和纳米纤维编织网络。由于甲壳素和立体空间骨架具有良好的生物相容性，该支架作为伤口敷料表现出优异的性能，可以促进细胞增殖、胶原沉积和伤口的血管生成，显示出其在生物医学应用中的潜力。

相关研究成果以“Chitin nanofibrils assisted 3D printing all-chitin hydrogels for wound dressing”为题于2024年3月6日发表在《Carbohydrate Polymers》上。

图1 全甲壳素基3D打印油墨的设计

1. 3D打印甲壳素/MACNF油墨的表征
流变测试是表征直接油墨书写（DIW）复合油墨性能的有效方法。首先研究了MACNF添加对甲壳素油墨的流变行为和可印刷性的影响。随着剪切速率的增加，所有样品的粘度都迅速降低，表明存在剪切稀化行为（图2a）。图2b显示了储能模量（G'）和损耗模量（G''）与振荡应力的函数关系。最终选择5 wt%、7.5 wt%和10 wt% MACNF的引入量进行3D打印。还测试了动态阶跃应变扫描，模拟了整个3D打印过程（图2c）。在1%和200%应变下连续进行3次扫描，分别模拟复合油墨的固态和流动状态，每个循环持续100 s。

图2 15 °C下测试的甲壳素/MACNF油墨的流变行为

2. 3D打印甲壳素/MACNF支架的纳米纤维结构和力学性能
选用甲壳素/5 wt% MACNF油墨作为例，所得支架保持了设计的形状，而不会出现明显的塌陷或变形（图3a，b）。通过SEM仔细观察支架的表面和横截面（图3c-f）。支架表面呈现出直径均匀约330 μm的多糖细丝结构，下层的细丝可以支撑上层细丝，从而承受重力。放大的照片显示，支架的表面是一个均匀的纳米纤维网络，其中包括甲壳素纳米纤维和MACNF（图3g）。压缩测试显示MACNF的额外量对甲壳素水凝胶网络有显著影响，进而影响其力学性能（图3h-i）。总之，甲壳素/5 wt% MACNF支架在印刷操作和应用中具有最佳的填料引入量和机械强度。

图3 通过SEM和力学性能进行形态观察

3. 3D打印甲壳素/MACNF水凝胶中的相互作用
随后，研究者采用XRD、FT-IR和XPS研究了3D打印甲壳素/MACNF支架水凝胶中再生甲壳素与β-甲壳素纳米纤维之间的相互作用。XRD显示了甲壳素/MACNF的聚集状态（图4a-b），特征峰变化表明MACNF的引入在一定程度上阻碍了甲壳素分子链的自组装和甲壳素晶体的形成。FT-IR和XPS表明，具有亲水性羧基和丰富含氧基团的MACNF可以通过氢键与甲壳素分子链相互作用，从而调节甲壳素碱溶液的溶液性质，使其复合油墨可印刷（图4c-g）。

图4 3D打印甲壳素/MACNF水凝胶中的相互作用

4. 细胞相容性和体内伤口愈合
随后，通过CCK-8和活死细胞染色评估了3D打印的全甲壳素基支架对小鼠成纤维细胞（L929）的基本细胞毒性。如图5所示，在与薄膜和支架组共培养1、2和3天后，L929细胞显示出健康趋势。从CCK8测定来看，细胞活性可以达到>90%，这证明甲壳素/5 wt% MACNF墨水对L929细胞几乎无毒。

图5 细胞相容性试验

为了进一步评估薄膜和支架的效果，在全层皮肤缺损伤口模型中研究了促进伤口愈合的能力。如图6所示，随着恢复时间的增加，小鼠的伤口逐渐闭合并减小。与对照组相比，薄膜和支架处理的伤口在3天后均有明显的收缩，表明甲壳素水凝胶具有促进伤口愈合的作用。HE染色结果（图7）表明，在显微镜下，薄膜和支架组的未愈合区域小于纱布组，均在一定程度上促进了伤口愈合。支架水凝胶更有效，这可能是由于微米级的孔隙结构促进了氧气交换以及过量渗出物的蒸发，为伤口愈合提供了更合适的环境。Masson染色表明，甲壳素可以通过促进伤口胶原沉积来加速伤口愈合，并且支架结构比薄膜结构具有更好的效果（图8）。此外，使用CD31免疫组织化学染色对血管密度进行进一步定量，以显示水凝胶在加速血管生成中的作用（图9）。

图6 伤口变化情况

图7 伤口区域表皮再生伤口的HE染色图像

图8 Masson染色图

图9 CD31的免疫组织化学染色

综上，本文成功构建了一种高分辨率、高形状保真度的全甲壳素基三维结构。MACNF能够作为增稠剂来调节油墨的流变特性。MACNF表面的亲水性羧基和丰富的含氧基团不仅能使其稳定分散在甲壳素溶液中，而且能与甲壳素分子链形成大量的氢键相互作用，参与甲壳素的自组装和聚集过程，从而赋予混合油墨印刷适性。三维多孔支架具有合适的机械强度，对细胞活性几乎没有影响。在伤口上应用相同配方的流延膜和印刷支架时，甲壳素显示出其优异的生物相容性和生物活性，促进细胞增殖、胶原沉积和血管生成，最后促进伤口愈合。由于支架的微米级孔隙结构，支架敷料下的伤口比薄膜敷料显示出更快的愈合速度。

文章来源：https://doi.org/10.1016/j.carbpol.2024.122028