体素化生物3D打印构建模块化双网络生物墨水微滴

来源：EFL生物3D打印与生物制造

当前生物制造领域在构建三维组织时面临关键挑战：传统生物打印技术难以精准操控高粘弹性生物墨水体素在三维空间中的组装，且单一网络水凝胶存在力学性能可调性有限、细胞相容性不足等问题。例如，基于海藻酸盐的单网络水凝胶脆性高、力学强度不足，而传统双网络水凝胶常依赖细胞毒性交联剂（如丙烯酰胺自由基聚合），限制了其在生物医学中的应用。   

来自美国弗吉尼亚大学的Li-Heng Cai教授团队开发了**体素化生物打印技术（DASP 2.0）**，通过设计无添加剂的生物友好型点击化学反应（降冰片烯-四嗪配对），实现了聚酰胺/海藻酸盐（PAM/Alg）或透明质酸/海藻酸盐（HA/Alg）双网络生物墨水微滴的数字组装。该技术利用多通道打印喷嘴实现高粘弹性墨水的按需混合，避免细胞损伤，并通过调控双网络的交联动力学和力学性能（如刚度、延展性），成功构建了复杂三维结构（如空心球体、陀螺状多孔支架）。体外实验证实其细胞相容性，体内移植实验显示支架在小鼠腹腔内可维持120天结构完整性。   

相关工作以“Voxelated bioprinting of modular doublenetwork bio-ink droplets”为题发表在《Nature Communications》上。

1. 数字组装球形颗粒（DASP）构建模块化双网络生物墨水微滴，通过开发基于聚酰胺/海藻酸盐（PAM/Alg）和透明质酸/海藻酸盐（HA/Alg）的双网络水凝胶，结合无添加剂点击化学反应（降冰片烯-四嗪交联）和多通道打印喷嘴，研究了高粘弹性生物墨水体素的三维精准组装及力学性能调控。结果表明，DASP 2.0技术可制备互连且可区分的水凝胶颗粒构建的复杂结构（如空心球体），双网络水凝胶的刚度和延展性可通过聚合物浓度和交联比例调控，且细胞封装存活率达60%以上。      

图1. 数字组装球形颗粒（DASP）的双网络生物墨水微滴构建流程。   

2. 单网络聚酰胺（PAM）水凝胶的交联动力学与刚度表征，通过流变学测试和理论模型分析，研究了不同NB/TZ比例和聚合物浓度对PAM水凝胶交联时间和剪切模量的影响。结果表明，凝胶时间随NB/TZ比例增加呈指数下降，剪切模量与聚合物浓度呈幂律关系（G∝c^2.1），理论模型（G≈kBT/ξ³）可较好描述实验数据，揭示了点击化学反应的动力学规律和网络形成机制。      

图2. 单网络PAM水凝胶的交联动力学与刚度表征。   

3. 双网络（DN）聚酰胺/海藻酸盐（PAM/Alg）水凝胶的力学性能，通过动态剪切和单轴拉伸测试，研究了双网络结构对水凝胶刚度和延展性的协同效应。结果表明，DN水凝胶的剪切模量约为单网络组分之和（如PAM₁₀Alg₂的G=11 kPa），拉伸断裂应变（εf=1.0）较单网络PAM（εf=0.36）提升近3倍，归因于弱网络（海藻酸盐）先断裂分散应力的机制。      

图3. 双网络PAM/Alg水凝胶的刚度与延展性分析。   

4. 双网络水凝胶的体素化生物打印与机械性能测试，通过开发双入口打印喷嘴和静态混合腔，研究了DASP 2.0打印复杂三维结构（如空心球体、陀螺状支架）的能力及循环压缩下的力学稳定性。结果表明，打印的空心球体由42个互连颗粒组成，陀螺状支架可承受60%压缩应变并完全恢复，能量耗散效率仅27.5%，显示出高弹性和结构完整性。   

图4. 双网络水凝胶的3D打印结构及其循环压缩性能。   

5. 体素化打印双网络支架的细胞相容性与体内稳定性，通过三通道喷嘴封装Beta-TC-6细胞并移植到小鼠腹腔，研究了支架的体外细胞存活、胰岛素分泌功能及体内长期稳定性。结果表明，打印后细胞存活率为61.3%±8.0%，3天后仍维持60%以上活性，且支架在体内120天未降解，结构完整，证实其生物相容性和机械鲁棒性。      

图5. 双网络支架的细胞封装、功能验证与体内移植结果。   

6. 透明质酸/海藻酸盐（HA/Alg）双网络生物墨水的普适性研究，通过替换聚酰胺为透明质酸（HA）聚合物，研究了不同生物基双网络墨水的打印适应性和细胞相容性。结果表明，HA/Alg双网络水凝胶的剪切模量（3050 Pa）和拉伸应变（εf=1.02）与PAM/Alg相当，细胞存活率提升至80%以上，且体内移植30天结构保持完整，验证了该技术平台的通用性。      

图6. HA/Alg双网络水凝胶的力学性能、打印性与生物相容性。

研究结论
本研究开发的体素化生物打印技术（DASP 2.0）通过生物友好型点击化学反应和多通道喷嘴设计，实现了双网络生物墨水微滴的精准组装与力学性能调控。研究表明，聚酰胺/海藻酸盐（PAM/Alg）和透明质酸/海藻酸盐（HA/Alg）双网络水凝胶可通过调节聚合物浓度和交联比例，获得范围广泛的刚度（400 Pa至22 kPa）和延展性（拉伸断裂应变达1.0），并成功打印出空心球体、陀螺状支架等复杂三维结构。体外细胞封装实验显示，支架可维持Beta-TC-6细胞60%以上存活率并保留胰岛素分泌功能；体内移植实验证实，支架在小鼠腹腔内120天仍保持结构完整，力学性能稳定。此外，透明质酸基双网络墨水的细胞相容性提升至80%，拓展了该技术在生物制造中的应用潜力。本研究为构建高复杂度功能性组织工程支架提供了新策略。

文章来源：
https://doi.org/10.1038/s41467-024-49705-z