国立台湾大学 徐善慧：天然生物材料与应用于生物3D打印技术的研究

台湾大学医疗器材研发中心副主任、组织工程与3D打印中心主任 徐善慧的《天然生物材料与应用于生物3D打印技术的研究》



丁建东：我们和上午一样，还是先把报告做完一起讨论。下一位是徐善慧老师，她是来自于宝岛台湾的，是国立台湾大学的。我简单科普一下，台湾凡是有国立这样的，没有民办这样的医学院。她本身是台大材料工程学的硕士，徐教授擅长做生物应用，她现在是台大的医疗器械研发中心副主任，他在3D打印方面有专门的研究，结合材料和3D打印。下面我们欢迎徐教授给我们作报告！
    徐善慧：谢谢丁教授的介绍！很高兴第二次参加这个论坛，我目前在台大高分子研究所。
    如果有人听过我去年的演讲的话，其实来之前我一直在想一定要讲到不一样的东西，不要让大家重复听到。所以问了一下我要讲什么，结果饶经理跟我说去年讲合成，今年讲天然，但是天然不是我的专长，但我认为这是一个很好的挑战。
    我自己是做材料，所以我会把重点放在生物3D打印和生物材料，里面有合成高分子材料和天然材料，它们各有优缺点。合成材料强度好，没有水性，天然材料有水性，但需要交流，可能有毒性。在去年8月27号的时候，我曾经想过一个可以水性的合成材料，大家看到我把“没有办法水性”这个特点，我把它改过来，写成可以水性。我做了6张片的片花，给大家回顾一下。
    我们用了PU的系统，因为PCL diol，我可以把它变成水性系统，所以它的好处是水性，不会融于水。现在这台打印机，已经完全使用太多年了。好不容易弄出水性的性能，大家可以看到它在低温情况下是可以列印的。列印出来的东西，它具有高的弹性，不管是哪种形态，甚至可以变成管子，它也比较有弹性。它的一个好处是在做打印的时候，如果是溶剂的系统和高温的系统，是没有办法把生长因子排入。水性系统，是可以排入生长因子。大家可以看到在3度的空间下，是可以促进软骨化。我们可以看到把这些干细胞种进去以后，Sox9是高度的强Col。而且特别是我列印的时候加一点点的HA，大家可以看到它的Col 9的现象会显著下降。这个是列印支架，而支架的一个很大好处，因为它是柔软了，虽然它卡在那个位置上。我们做了一些粗浅的兔子软头缺损修复实验，可以看到加了这个软骨以后，在一个月以后它的修复比较良好。
    当然刚刚的水性支架，它是要列印完了之后再把细胞种进去。把细胞种进去，这是第一个层次的组织工程。做下一个层次，是希望把细胞和支架一起打印出来，这是组织工程较高的境界，我把它叫做“君子莫大乎与人为善”，就是能够把细胞和材料共同印出来。这是用3D打印机打印出来，我们可以看到这里有白细胞。然后我们用了这个列印出来的迷你大脑，里面还有神经干细胞，然后把它植入斑马鱼受损的大脑以后，可以观察到它的运动神经恢复，也可以发现之后秘密大脑的存活率增加，如果是脑部损伤，它经过几天会死亡。从影片就可以看出来，受伤的大脑是不会动的，如果你是一个损伤，在6天之后会死亡。其实这是上次我跟大家分享过的水性和3D列印。
    接下来还有什么可以改善的呢？我们先看第一个改善方案。早上危教授提过把材料变聪明，让它有形状记忆。因为它是PU是一个软连接，我们在置换这个软连接以后，我们可以让它有形状记忆，一个卷曲的东西，过一段时间可以水里面恢复，它在水里面可以很快恢复。另外我们还可以继续改善它的软内断，让它可以稳固堆叠。因为堆叠实在是一个很大的问题，不过合成的材料，因为它的强度比较高，所以它堆叠几层是没有问题的。第三个是什么？从这里我要开始切入今天的主题——天然高分子。我们希望能够借用天然高分子比较高的生物相容性，以增强它的列印特性。这是我们在天然里面加一些大豆蛋白（SP），然后列印出来。下面这个图是我做小角度的X光照射，可以看到如果是PU的话，你会看到一个HA，我们就发现大豆蛋白和PU之间有一些交互作用，会让它产生扭曲结构，也让它的列印变得更加容易。但是这里有一个很大的问题，什么样的问题呢？虽然细胞在里面加了大豆蛋白以后，因为它的生物会长得很好。其实今天这里徐总也提到这种影响很重要。天然高分子有一个很大的好处，就是它的透明。可是合成高分子加上大豆以后，其实大家可以看到它是不透明的。虽然天然的组织是不透明的，但是这是一个很大的麻烦。所以这个细胞如果列印很厚，我还要找很久很久，不知道它到底是不是细胞，因为支架本身也会有一些外挂，所以众里寻他千百度，不知道那个细胞是不是细胞，所以天然生物材料是非常重要的。
    接下来我就要进入今天的主题，就是天然生物材料、3D打印。
    天然生物材料、3D打印有什么好处呢？是天然构成，在过去多年的文献里面都有列印，这个列印就可以很好地区分生物相容性是否好。我自己在过去30年的研究里面，其实天然高分子我做得不多，我只是把它拿来当做一个工具使用，因为我喜欢做合成。但是天然的高分子，我有一点点小小的经验，我认为这个可以结合生物3D打印。就是什么？列印单颗细胞，我希望能够列印打印细胞群，一群的细胞。
    我首先跟大家介绍一下，这是我们几年前的发现，我们发现把界面干细胞培养在壳聚糖或者壳聚糖酸感知的玻尿酸上面，这些细胞会自动组装，然后细胞球。我们认为这个过程是模仿发育生物学，所以它除了可以让干性提升，干性提升是所有全球的细胞都发生的。
    我们这个成球跟别人的球有什么不一样？大家可以看到它是动态成球，它是先贴再拉，互相拉扯，然后再把它拉成球。所以我把这个过程取了一个名字，叫“CellAssembly”，就是拉来拉去，就是组装成一个细胞球。
    这个细胞球还有一个特点，就是因为它是拉来拉去拉成球的，所以跟其他成球方式不一样，我们可以标定细胞，或者把我们要的的植体基因趁这个过程植入到里面。因为我在这个球的时候做了一个实验，就是我放了一个SHI、Foxd3，所以我觉得Foxd3很重要。其实我找文献的时候找到中国有一个平教授，我就写邮箱给他跟他要Foxd3，他就寄给我。然后我就做了一个实验，发现这个球可以量身订作，拿这个细胞，基于这个成球的过程，把Foxd3不转进去以后，它就会变成类神经，我们可以在中枢神经里面可以看到，它会让斑马鱼的中枢神经受损，原来用酒精去把整个中枢神经破坏，但如果是这样的一个细胞球的话，可以让中枢神经功能恢复。
    既然细胞球有这么多的优势，我们花很多时间去把这个平台建立，让我们再生医学使用，那接下来，我这个题目是《天然生物材料的3D打印》，所以我们要回归，我们用了哪些天然生物材料？第一个想到的是壳聚糖，因为壳聚糖可以让细胞长得很好。所以我们就用几滴糖融在醋酸里面，然后用3D打印列印出来的支架，也发表在2012年。当然发表之后有一个问题，因为它是醋酸，没有办法高细胞列印。幸运的是在2013年，在一个年终会议的时候，有一位教授知道它里面有一个壳聚糖的CF HYDROGNL，它这个CF HYDROGNL就是运用Gelatin，因为这个不需要酸溶，如果你直接让它打印，它是会溶掉。这个时候他做了一个PEG，然后做成为了这个凝胶，我们在第一期工作里面证明它可以促进神经的修复。在去年的时候，我们又进一步发现一件事情，我们把这个神经修复的效果水凝胶，发现壳聚糖并不能促进血管的再生。而且待会儿会证明壳聚糖会抑制癌症，所以它也能抑制细胞的再生。但是我们只加了一点点天然的Fibrinogen的东西，加了0.002%，加进去以后它就变成了新凝胶。这个胶，可以具有血管修复效果。但是可以看到，如果是正常的LG，它不会修复，如果是加一点凝胶，它的修复效果更高。它这个自修复很快，所以它是一颗一颗的。因为它自修复效果更好，所以它很快就变成了这样，我们认为这是互穿网路造成的，我们也证明了这应该是互穿网路，因为我们用DFC去证明它的分化和变化。然后我们把刚刚加进去的顺序变化了之后，它不会形成互穿，因为互穿网路要搭配形成，一个形成了这个网路，另外一个穿不进去。我们用这个机器证明它是互穿网路，造成了它更好的一些特性。我们也发现血管内的细胞在种到这个胶里面，它就会成管状的形态。我们进一步把它注射在斑马鱼，这个斑马鱼是一个基因改造的斑马鱼，它所有的血管都会有绿色的荧光。这个是一般的PDS打进去，这是正常的血管，在腹部这边。如果打上水凝胶，会发现这些血管变少了。但是如果把新的这个加一点，打到斑马鱼的腹部，发现这边有大量的血管。我们又进一步用了左下肢缺陷，就是把这个造成缺陷，就这样打进去之后，就发现打CF HYDROGNL这一组，老鼠缺血的状况改善了。
    所以基于刚才的研究，我们认为壳聚糖这一类的东西，应该是一个好的生物3D打印材料。
    我这边用一个例子说明我们怎么样打印细胞球。刚刚的细胞球的好处是，它可以把N种细胞自组装起来。自组装的时候，会因为下面的基材有变化，造成各种不同层次的特性，这样就可以模仿发布生物学上细胞与细胞之间的交互作用。以左边这个图来看，可以看到以这个系统来说，缺氧区域移动，我们认为这会有利于外来血管的形成，这种形成全部是CULTURED，就是核核结构，然后神经干细胞在外面、内皮细胞在里面的细胞球。
    接下来，我们用壳聚糖和这个Gelatin都进行了列印。这个Gelatin是我跟另外一位教授，这个汇报在我前面，有很多人用到。但是它这个要列印，需要一点技巧，因为它固定时间就会交融，你在交融之前就要把它列印出来。我们有试过，不管是Gelatin还是CF HYDROGNL，它都可以列印出来。当然如果要列印多层的话，我觉得它的稳定结构，是没有像合成材料那么好。
    我们也把我们的细胞球跟它共列印之后，发现经过打印的细胞球，它的结构还在，并不会影响它的增生能力。
    当然，在未来我们希望能够做多细胞/多材料血管网路生物3D打印列印。刚才也提到没有血管，它不可能长期生活。我们在今天也运用一个材料，这个材料都可以买到，它对糖类敏感，可以注射出小管。我们可以怎样？我们可以在任何一个材料里面，我们如果看原先的构想的话，这是哈佛杰尼夫画的一个图，他认为不同细胞列印，有些是要做成中空，中空的水凝胶里面长血管。我们也可以用这种合成的方法，来让胶里面长出血管，这是我们在最近发表的，可以看到用对糖敏感的水凝胶，中空的CELL LNK就会形成，因为它对糖敏感，然后里面就长出微血管。所以不管是合成或天然的，它都可能会长血管。如果是合成的话，就必须要把它列印出微小的管路，让它可以长血管。
    接下来给大家看一下神经干细胞和内皮细胞的核壳结构的细胞球，放在Gelatin里面去打印出来的结果，可以看到在长期培养之下，居然内皮细胞好像要伸出来，要长微血管。但是，因为所有天然材料作为一个球来讲，所以这好像又要出来又不出来又要躲回去，然后Gelatin分解嗲之前，它还没有长出来。所以，我们认为它有长血管的潜力，但是目前我们还没有看到它的生长。这个是混球，这个是骂人的“混球”，它具有血管新生的潜能，因为它所有跟血管新生相关的基因导线都是增加的，在这个打印的细胞球里面。
    所以我们现在要回到原先的大问题了，就是合成材料好还是天然的材料好，也为我去年和今年的两个不同的题材做一个小结。
    因为我自己不是天然高分子的专家，所以这是我自己个人的意见。
    所以一个生物3D打印墨水必须做到什么？根据几年的研究，我有个人一点点小小的浅见。刚刚杂七杂八跟大家分享了很多，所以我在这边斗胆借用一千年前北宋哲学家张横渠先生的名句，来跟大家讲。第一，它必须在天底之间顶出一个稳固的3D空间。如果是用合成和天然材料和比的话，合成好像更胜一筹，因为它的Mechanical比较好。第二个条件是什么？就是它必须要让每一个细胞活得好好的，所以它必须要很好的生物相容性，这里面牵涉到养分、氧气的代谢，以这个层次来讲的话，天然材料好像又更胜一筹。第三个条件是什么？除了让细胞存活，你必须要让细胞在长期，当水凝胶分解之后它能够存活，而且顺利地工作。以刚刚来讲，它必须要能够做代谢。在这个层次来讲的话，合成和天然很难说谁好，因为合成的高分子比较容易设计它的DEGRADATION。如果以growht来讲，当然是天然比较好。所以这边我要打一个问号；所以第四个就是要有血管网络，一定要开通四通五达的血管网络，才能让这个列印出来的组织永远存在那里。我认为这个必须要借用合成和高分子的共同好处。
    所以我简单做一个小结。我认为在未来，我们可以通过天然高分子和合成高分子的结合，天然高分子有相容的好处，合成高分子有能堆叠的优点，然后我们可以运用细胞自组装或者利用多种细胞的列印，Cell A、Cell B模拟发育生物学的先进性，让它们能够结合起来。
    相信通过这些多元元素的携手合作，必定能够共创生物3D列印的大未来，以造福人类，创造20年高质量的生活，70岁到90岁，谢谢！