南京大学鼓楼医院关节外科史东泉：控制Kartogenin透明质酸凝胶修复关节软骨的研究

丁建东：非常感谢徐教授！徐教授的每次报告，总是既哲理又诗情画意。后面一个，本来是蒋青教授，现在由史东泉教授来作。蒋教授是鼓楼医院关节外科的主任，史教授是副主任。史教授国家优秀青年基金获得者，我相信他在一线也工作若干年，肯定会有自己的见地，下面欢迎史教授给我们作报告！

南京大学医学院附属鼓楼医院关节外科副主任 史东泉的《控制Kartogenin透明质酸凝胶修复关节软骨的研究》

    史东泉：尊敬的戴院士，谢谢主持人丁老师！
    我们也瞎做了一些东西，但是未来也许可能不是白做的，我觉得我们也在谈一些转化的事。
    作为一个关节外科大夫，大家知道我们整天就知道换关节。其实我们平时也想砸砸自己的饭碗，所以我们也想把软骨修复修复。所以我们进行了软骨修复做了一些工作，跟大家汇报一下。
    从临床上来讲，软骨实际上真的非常糟糕。我们做过大量的流调，就是在一个小区里面60岁里面，问问他有没有膝关节不舒服，60%以上的人都有这样的体验，觉得我确实很久没有蹲下去了。这样的问题，最终主要的问题出现在软骨上来。很明显的，这是我们在置换膝关节，但是白色软骨四周都磨没了，我们可以看到他的软骨下骨。但是我们想想国内有将近八千万的患者，需要去塑造这样的软骨。
    目前来讲，其实从临床上来讲，我们有很多的方法。我们可以看一下，我们想做软骨再生的时候，我们发现这样的病人有大量的有局灶性软骨缺损，当然还有一些年轻人的弥漫性的软骨缺损。现在有很多问题，包括种子细胞、一体化、软骨表型的问题，始终没有一个功能性的软骨。上午很多老师讲了他们的研究，其实作为临床大夫来讲，我们是希望策略越简单越好，而不是说越复杂越好，因为越复杂就越难开展。
    我们每天早上7点点8点钟都有讨论，这样的小分子有机化合物就是他们讨论的东西。我们在2012年发现，这个小分子对骨髓间充质干细胞有明显的向软骨方向分化的作用。对于我们做软骨的人来讲特别敏感，一听到有这样的软骨有什么样的作用，我们会再继续探索。在2014年的时候，发现有人把小分子分开，发现对滑膜关节的软骨发育有很好的促进作用。我们再进一步探究它的机制，发现这样的小分子有机物跟我们软骨相关的分子有强烈的相关性。在这里，我们就在想能不能建立缓释组织工程支架体系，从而获得与天然软骨相接近的材料？
    对于这样的课题，大家一起坐下来谈，想要解决哪些问题？第一个，我们作为古柯关节大夫来讲，我们发现膝关节里面更多是滑膜，滑膜里面用大量的间充质干细胞。既然告诉我们这样的小分子有机物对骨髓间充质干细胞有成软骨作用。那整个课题告诉，滑膜类型的间充质干细胞作为成软骨种子细胞，以骨髓间充质干细胞更有优势。而且很多临床上的疾病，当时生出来这样的组织，跟软骨有很相似的外形形状。如果它对滑膜间充质干细胞有成软骨作用，我们就去探索到底什么样的浓度是最佳的。如果我们找到这样的浓度，那我们是不是拿到往关节内去打。如果关节内打打，我们发现能不能在临床上尽量去运用它？这一系列的关键问题，就造成了这样的课题，我们希望通过我们的研究，把这样的几个关键问题解决掉。
    于是我们开始了研究内容的设计。我们希望把滑膜和间充质干细胞分离出来，我们希望它也有软骨作用，进一步想往天然软骨方向转化。
    那么我们就开始了我们第一步，我们把膝关节的滑膜取下来，取下来以后进行培养。我们发现到8个月以后，我们特别兴奋地发现得到了这样一个组织，我们只是做了一个离心的培养。当时，我们看到这样的组织以后挺兴奋的，因为跟我们手上看见的软骨已经渐渐相似了。我们做了KGN，我们发现这样一个类软骨的组织，我们发现在这个软骨里面有大量类软骨的细胞，有组织的形成。我们当时就在想，这样一个类软骨组织到底是纤维软骨还是透明软骨？因为天然关节内是透明软骨。当然如果我们经常不去手术，慢慢它转成纤维软骨。
    做软骨都知道II型胶原是天然软骨的关键，所以我们就去做了这样一个荧光，我们发现这样一个类软骨组织里面，有大朗的II型胶原的表达。再比如我们的类天然的组织，很有可能跟天然透明软骨相近。于是我们又做了现到4个礼，发现加入这个小分子有机物这个组里面的II型号胶原表达特别强烈。我们又检测纤维软骨透明性的表达，的时候，跟对照图比有明显的缩小，但是没有让我们特别开心、惊喜非常自信地的结果。这个小分子有机物是对于膝关节里面滑膜间充质干细胞有软骨方向的分化。
    到这一步以后，我们就想既然它有这样的作用，那就往关节内打打。于是我们就设计了第二部分，就是把这个小分子有机物往关节内打打，因此我们把在膝关节挖了一个洞，每个礼拜打一次，连续打三个月。到4个礼拜和12个礼拜的时候，我们去看这个兔子的组织。我们发现到4个礼拜的时候，虽然说跟对照图比有明显的缩小，但是没有看到让我们特别开心、惊喜的结果。但是到12个礼拜的时候，我们发现关节内打小分子有机物的注射组，明显跟对照组比，有很好的治疗作用，填充非常完整，边缘相连。我们知道其实作为软骨修复来讲，它不止是软骨和软骨下骨的一个紧密连接，包括软骨和周围软骨的紧密连接，是一个三维一体化的过程。所以紧接着我们用了甲苯胺蓝色，我们发现4个礼拜的时候，跟对照比好像小了一点点，但是到12周的时候，发现我们在关节内打的这样一个控制它软骨修复最糟糕的一组，都比我们对照组要好很多。我们用番红O染色去验证我们这样的结果，同样地发现，我们治疗组的最差的都比对照组最好的都要好很多。于是，我们又去做了II型胶原免疫组化，我们发现这样的一个组织跟对照组比，显然是有更多的II型胶原的表达。同时我们也检测了I型胶原，发现修复组织I型胶原的表达是很弱的。所以从这一步来讲，就是可以得出这样的结论，就是关节腔里打这样的小分子有机物，是可以治疗软骨缺损，我们也发表在arthritis research  therapy这样的的杂志上。
    其实这个过程还有很多的问题，想要去做临床转化的，因为我们都知道反复地这样的注射，对我们外科大夫来讲是非常担心的，因为不停地注射三个月的话，非常容易感染。而且我们关节内，到底到我真正缺损的地方有多少有效的治疗浓度？这也是有困惑的。同时，如果对南京的病人来讲，他一个礼拜来打一次，打三个月，可能他还可以接受。如果是哈尔滨或者是北京的话，让他每周来打一次，显然在临床上是不可能推开的。
    于是我当时考虑想在缺损的地方，表面能够有一个喷雾的东西，喷到关节的表面，就变成一层固定的膜。但是我当时没有参加过这样的会，如果有这么多老师知道我就好了。我跑到南大的高分子系，跑到很多搞高分子的地方。如果有一个东西，像喷雾喷到缺损的地方，变成坚硬的膜，来兜住我自己的药物的话，这是非常困难的。因为只有这样的一个操作过程，才能可能在临床上操作，我可以喷点雾喷到缺损的地方，然后形成固体，或者在体温作用下变成固体，能够兜住局部的药物，这才是可能转化的。
    经过一年多的寻找，我才寻找到这样的材料。我跟我高中同学聊天，聊聊我在做什么、我在做什么，把我的困惑告诉他。非常幸运的是他正好做高分子，然后他说我帮你去想想这个东西能不能去解决，但是不一定是这种膜。于是他就回去，我们也不停地在沟通交流。于是回去以后他做了一个月告诉我，他说我想了，可不可以用在临床上？他说我把你这个药物包裹在液体里面，然后打到你缺损的地方，我给你固化，这样局部的液体就不会跑，而且能给你有效释放，到底释放能多少？可能还需要我们一起讨论。于是他进行了另一个实验，他发现HA照射了以后又变成了固体。
    同时，我就四处找可以发紫外光的机器。后来好不容易在苏州发现有这样的发光器，因为只有这样的发光器，才有可能在临床上，我在膝关节打一个洞，高温消毒以后，可以在关节内使用。
    现在汇报的时候，可以把几秒钟的东西过一下，其实我们光这个紫外光发光的条件就用了三个月，就是到底在缺损的地方距离多远、发光的强度多少、时间有多长，其实这是反复过程当中。一开始做的时候，一发光就把软骨烧红了。所以在不断摸索的过程中，才找到了相对比较可靠的照射过程。
    同时，他又帮我把它这个小分子有机物用纳米包裹，他发现在体外显示方两个月，基本上在这样的包裹下问题不大。如果前面两部分的实验是非常可靠的话，其实到了第三部分，这样的试验结果是我们很有信心，一定会比前面两次更好。所以我们到12周三个月的时候，发现这样的软骨和天然软骨几乎没有任何的差别。
    同时，我们做了各种染色，包括甲苯胺，包括番红染色的评分，都跟天然的没有太大的区别。到了4个礼拜的时候，我们从番红染色看，还有几个支架还在，还没有完全吸收。但是跟4个礼拜的对照图比，有明显的很好的修复作用。到12周的时候，我们特别开心，因为我们发现这样的修复组织周围的液体基本上没有了，这样的修复过程发现，跟周围正常软骨比，发现跟它之间没有任何的变化。
    我们用番红进行染色，更让我们兴奋的是我们发现这样的软骨跟这样的软骨下骨的完全已经紧密结合在一起，没有用分体的支架粘在一起，完全是靠同一个支架在不同环境作用下进行自己的软骨生长。我们现在也投入很大的课题组，专门想看为什么这样一个交界的地方，在周围骨环境的情况下，跟周围关节内软骨不同微环境下，为什么骨、软骨能够一体化长得这么好。
    我们进行了II型胶原修复表达，我们发现这样的修复组织的II型胶原表达甚至比周围软骨的II型胶原软骨的表达更要好，说明我们这样一个修复组织是非常接近于类天然软骨。我们又去做I型胶原，就是说我们这样的修复组织，基本上不会是这样的纤维软骨的成分。
    我们随机取了一些修复的软骨条和正常的软骨条，我们送到北医三院敖英芳进行检测生物医学，无论是硬度方面，跟正常软骨相比都没有太大的区别，说明我们这样的修复软骨是非常接近天然透明软骨。
    其实对于我们临床大夫来讲，想要在临床上能够推广或者非常好地利用，现在也是大家关心的。因为我们这样的技术，跟原来的软骨细胞技术相比，大家都知道原来的软骨细胞要取正常的非修复性的软骨进行体外培养再植入体内。这样的两步法，造成了这样的软骨细胞移植手术并不得到临床大夫的非常认可，第一当然是因为它的费用非常贵，就算它搞活动，打折下来也要5万块钱。我们这样成本，只要2万多块钱能解决，从成本上得到很好的降低。同时，我们不需要开放手术，只需要在关节下操作，我们在打支架的时候，可以把关节内液体全部吸掉，暴露缺损的地方，我们可以把这样的支架注入到这样的地方。更重要的是，其实软骨并不是大家想象中的规则的圆柱形、立方体的，所有的骨软骨移植手术都需要破坏正常的软骨。而我们这样的情况下，无论你损伤的软骨是什么样的形状，我们不关心，我们用这样的液体支架植入你原来损伤的组织，而且我们根本不需要取任何软骨细胞，也不需要体外的干细胞，完全利用体内的滑膜间充质干细胞，还有骨髓间充质干细胞进行这样的工作。
    这样的国家发明专利，我们现在在谈怎么样在林场上进一步推广。我想用一个简单的动画给大家介绍一下我们这样的技术，其实这样的缺损是不规则的，我们把它打进去以后变成固体的支架，同时在局部释放我们的药物，周围各种种子细胞的归巢，最后修复。谢谢！