Science大作深化：旋转光固化3D打印快速构建复杂活体组织

来源： EngineeringForLife

目前生物3D打印方法包括基于挤出，立体光刻(SLA)和数字光投影打印(DLP/ DMD)等（详细生物3D打印分类可参考综述：漫画生物3D打印Part II：打印方法及工艺） 。这些打印方法都是基于层层堆积（layer-by-layer）来构建三维结构的，通常需要支撑材料来实现中空或悬垂结构的打印，大大限制了复杂结构的精确制造。此外，打印大尺寸组织结构需要很长的时间，这就迫使细胞在墨盒中留存时间过长，大大影响细胞活性。因此，提高打印效率和精度成为生物3D打印工艺研究的热点和难点。

2019年1月加利福尼亚大学伯克利分校的Brett E.Kelly、Indrasen Bhattacharya、Hossein Heidari在Science上发表的“Volumetric additive manufacturing via tomographic reconstruction”提出一种全新的打印技术，他们开发了一种计算轴向光刻（CAL）方法，该系统能够选择性的固化容器内的GelMA水凝胶（GelMA：甲基丙烯酸酯明胶，EFL可提供标准化的、成系列的GelMA产品），能够把三维物体分解成为一组二维图像并从不同的角度投射出来，让光敏液体固化成所需要的三维形状。在不同的精度和材料条件下，打印时间仅需30-120秒。该套系统的最高精度可以达到0.3毫米。

图1 A)三维模型不同角度图像的投射，B)打印原理，C) CAL打印过程中不同视角，D) 打印成品，E) D的清晰化模型 ，F) D的更大尺寸模型，G)添加紫色染料的F模型

随后，瑞士洛桑理工学院的 Christophe团队在CAL方法的基础上，进一步提出了“高分辨率的层析制造法”技术，极大地提高了打印速度和尺寸范围。该技术通过将一个圆柱形的树脂容器设置成旋转的，一边有DLP调制器产生的光对容器进行照射，这些光与树脂容器的旋转运动同步显示，在短短几十秒的时间内就可以实现打印的完成。相关论文“High-resolution tomographic volumetric additive manufacturing”发表于“Nature Communications”。

图2高分辨率层析打印实验装置

近期，乌得勒支大学医学中心Riccardo团队，同瑞士洛桑理工学院Christophe团队合作，在CAL技术的基础上做出了更进一步深入研究，引入了一种体积生物打印(VBP)的概念，使得在几秒到几十秒的时间内制造出具有任意大小和形状的细胞负载结构，实现了在极短时间内完成生物墨水厘米级的适用于临床尺寸的精细结构成形，其成果“Volumetric Bioprinting of Complex Living-Tissue Constructs within Seconds”发表于“Advanced Materials”。

研究中针对以上传统打印中出现的问题引入了体积生物打印(VBP)的概念，VBP技术能在几秒到几十秒的时间内制造出具有任意大小和结构的整个细胞负载结构。VBP是受计算机断层扫描(CT)的启发，通过使用二维动态光场照射，从而制造更为复杂的物体，能够实现打印产物的分辨率在80um以下。体积打印技术将物体的分层打印变为一次性创建整个对象，从而克服了传统生物打印技术因打印时间过长对细胞造成的损伤，其打印精度也到达了传统打印方法无法企及的程度，可以打印出解剖学上正确的骨模型以及半月板的植入模型。该研究中的生物墨水被放在圆柱形容器中，以允许其实现空间选择性交联。为了实现这种三维空间中的剂量分布，容器被设置成可旋转的，并与一系列2D光同步照射，通过一个DLP调制器和一个405nm激光光源，这些动态光被显示到生物墨水中。

图3 A)装载有生物墨水的打印容器连接到一个旋转平台上，B)用于打印人体耳廓模型的层析投影示意图，C)打印出来的水凝胶结构的效果图

研究中选用GelMA为所打印生物材料，PBS为溶剂，LAP为光引发剂。由于打印过程中对于打印产物精确性的要求，光引发剂存在一个浓度上限，简而言之，在配制生物墨水是要严格控制LAP的浓度范围，使光能够穿透整个打印结构的同时又必须能使生聚合，同时也要保证LAP毒性对细胞损伤降到最低。为了达到这一目的，光强度值至少要达到入射光强度的37%才能到达打印体的另一侧(图4A)。VBP在精准制造上的能力可见一斑，当通过比较计算机断层扫描(CT)获得的打印产物和原始STL文件时，得到打印的人类耳廓模型显示体积变化仅为5.71±2.31%。与其他打印方法相比打印时间不受打印结构尺寸限制，打印物体放大二倍、三倍后同未进行放大处理的模型用时相同（图4B），相对于挤出式打印方法、DLP打印方法的打印时间随着打印模型体积的增大而增大，VBP打印方法占有极强的优势。DLP打印方法可通过减少每层提升时间来加速打印过程，但相对于VBP方法其使用时间也要高出一个数量级。在体积生物打印技术中，只要提供给光敏聚合物相同的辐照强度，打印时间就可以保持一致，而与打印物的体积无关。

图4  A)生物墨水添加LAP后，光透过整个打印体量的图形表示，B)使用不同的生物打印技术:VBP、挤出生物打印、DLP，按比例1×(0.15 cm 3)、2×(1.23 cm 3)和3×(4.14 cm 3)制作人耳模型的时间

其次VBP方法打印出的结构不会出现打印痕迹，打印物表面非常的光滑（图5），在研究中的光学条件下，体积边缘的分辨率仅为33微米。

图5 通过(i)VBP打印、(ii)挤出式打印(iii)DLP(标尺= 500微米)打印的耳廓表面特写图像

VBP生物打印技术中，不需要牺牲材料就可以打印出悬臂部件。这一特性便于生成能够可逆地变换打印后形状的结构，如打印刺激响应材料(通常用于4D打印)结构。利用这一特性，本文设计了一种流体阀，通过悬浮打印从而得到封闭空间内的球体，连接到流体系统时可正常工作（图6）。使用VBP打印技术可实现对小梁结构和错综复杂、相互连接的多孔网络的制造，超越了传统基于挤压的生物打印技术。使用体积打印方法，这些结构被成功地复制，最小的分辨率为144.69±13.55um。

图6 流体球笼阀的VBP打印（i）计算机生成的阀门三维模型，（ii）打印阀门俯视图(scale bar= 2 mm)，（iii）阀体流动的特写(scale bar=1mm)，（iv）打开状态（箭头代表流动方向），（v）闭合状态

使用VBP打印方法时，在室温下进行打印有利于防止打印过程中的细胞沉积，室温状态下的GelMA生物墨水还为打印结构体提供了稳定的定位，避免了因交联后浮力的潜在变化或生物墨水容器的旋转而致使的已打印部分的运动。即使在打印其他不像GelMA这样的黏度随温度变化的光固化生物墨水时，由于VBP过程的快速，也可以实现均匀的细胞悬浮。最后,选择性地交联生物墨水后,未反应的生物墨水在37°C的环境下用PBS或水就可以很容易的冲洗掉。VBP生物打印作为一种无喷嘴的方法，不会出现挤出式打印中由于施加剪切应力而产生的细胞损伤和打印形貌破坏。活组织的功能主要归功于其复杂的结构，对细胞命运起到决定性因素的是细胞外环境相关形态和生化信号的精确分布，在这一点上VBP打印方法可以很好的确保外环境的精确还原。

图7 VBP打印出的半月板形结构相关评估和新组织形成 A)（i）计算机生成模型,（ii）生物墨水打印样品体外培养28天 (scale bar= 2mm)，（iii）打印半月板的三维结构的CT扫描，（iv）整个打印过程中，观察到7天内细胞存活率很高.B)代谢活动在7天内增加.C)新组织形成方面，打印结构中糖胺聚糖生成量的显著增加，以及在28d培养期间半月板压缩模量的增加.

综上所述，本篇文章突出说明了VBP（体积打印）打印方法能够快速创造大型的、自由形态的细胞结构，与传统的生物打印方法相比，打印时间大大减少，并制造高细胞密度的打印物。VBP生物打印的快速性在组织打印和疾病模型研究上具有很大的优势，生成任意形状的大型组织结构可以帮助患者特异性治疗，VBP生物打印技术很可能广泛应用于组织再生、体外组织和疾病模型研究以及软机器人技术。


参考文献：
[1] Kelly B E , Bhattacharya I , Heidari H , et al. Volumetric additive manufacturing via tomographic reconstruction[J]. Science, 2019.
[2] Damien Loterie，Paul Delrot，Christophe Moser, High-resolution tomographic volumetric additive manufacturing[J]. Nature Communications, 2020.
[3] Paulina Nuñez Bernal, Delrot P , Loterie D , et al. Volumetric Bioprinting of Complex Living-Tissue Constructs within Seconds[J]. Advanced Materials, 2019.