3D打印纤连蛋白材料支架

来源：EngineeringForLife

纤连蛋白（Fn）是正常组织中含量最多的ECM蛋白。Fn表达的上升与多种癌症有关。例如在乳腺癌恶化的过程中，纤维纤连蛋白（fFn）会促进肿瘤的生成和迁移，一方面是因为恶性细胞中发生了上皮间质转化（EMT）。除此以外，Fn含量上调被认定为是癌症转移壁龛形成前的重要一步。Fn作为一种机械敏感性蛋白，当溶解在血浆中时总以比较紧凑聚集的状态存在，而当存在于ECM中时（例如fFn）则处于各种各样的拉伸状态。Fn的结构则决定了影响其生物功能和细胞响应的结合位点是裸露还是隐蔽。Fn的原纤维生成需要通过力学迁移绑定在细胞表面受体上的整合素，来解构蛋白。而从结构角度来说，这一解构过程大部分发生在I型位点（Fn-3），这一区域会暴露自缔合位点来促成随后的原纤维生成。然而多年以来，人们依旧无法完全弄清Fn的I,II,III型位点是如何相互以及与细胞作用，从而形成原纤维的。除此以外，如何生成稳定有效的fFn纤维网络也是一个难点。虽然之前有很多研究实现了无细胞的生成Fn网络，但是这些方法通常在应用到细胞培养和分析时，往往缺乏以下四个特点：i)有效的细胞渗入和去除能力ii)足够透明易于观察iii)为细胞沉积基质或者黏附提供一个支撑iv)足够大面积的没有合成材料的3D空间。

纤连蛋白（Fn）作为一种尤为重要的细胞外基质（ECM）蛋白，常常在2维或者3维的细胞培养系统中，被用为涂层来创造一个能够支持细胞存活的环境。但是，这些蛋白涂层的涂覆方式都和体内细胞沉积出来的用来组成ECM的Fn网络的结构和功能不一致。近期，来自密西根大学的Joerg Lahann教授团队在Advanced Materials杂志上发表了题为Engineered Fibrillar Fibronectin Networks as Three-Dimensional Tissue Scaffolds的文章，报道了一种用网格状聚合物支架支撑，无细胞，力学性能好，且尺度可控的3维纤维纤连蛋白（fFn）网络。作者通过在空气，Fn溶液和网格支架的3相交界处，通过水动力诱导的方式，可以形成十分稳定的fFn网络。该fFn网络可以促进细胞的渗透和增殖，并可体外扩增原代癌细胞，诱导其间质转化。未来，该人造fFn网络有望应用于基础细胞研究，精准医疗，药物测试和临床前诊断。

图1. 水动力诱导Fn原纤维生成

作者利用支架轻微剪切Fn溶液（角速度8转/分钟），在空气，Fn溶液和支架三相接触部位产生非溶液状态的fFn网络，整个过程没有使用变性剂（图1）。支架利用3D jet writing[2]方法打印PLGA获得，带有500x500um方形孔，厚度120um，可为细胞的渗透和生长提供更大体积的悬浮蛋白基质。所制造出的fFn网络与人类纤维母细胞沉积的基质的形态类似。

图2. fFn网络在老鼠乳腺癌模型中提升肿瘤移植效率

由于Fn为原发性乳腺癌细胞外基质的主要成分，作者测试了fFn网络在老鼠乳腺癌模型中提升肿瘤移植效率的能力（图2）。首先，作者在支架上培养了AT-3小鼠乳腺癌细胞，这种细胞会在fFn网络上稳定表达萤火虫荧光素酶。随后，带着30000细胞的fFn支架被植入免疫活性C57BL/6老鼠。生物放光成像图片显示，在支架中，初始的肿瘤生成信号在植入后两天便出现。相反，在细胞悬液中经过21天也未曾出现肿瘤移植。移植肿瘤的组织学图片显示，癌细胞经过fFn网络侵入了周围组织。增长的致瘤性与体外测试结果一致，fFn网络中的AT-3细胞增加了肿瘤初始亚群（CD29+/CD24+）和转移（CD29+/CD24+/CD90.2+）。

图3. fFn网络增加MDA-MB-468人类乳腺癌细胞的肿瘤初始细胞量

随后，作者又测试了fFn网络在人类三阴性乳腺癌细胞中是否也会增加致瘤性。选用了MDA-MB-468细胞系列（图3）。四天的扩增之后，MDA-MB-468细胞形成了扩展面积达到10平方毫米的致密3D癌症微环境。与培养在组织培养聚苯乙烯（TCPS）上，和Fn涂覆的TCPS上的细胞相比，fFn网络上的CD44+/CD24−亚群显著高于前两者。除此以外，在所有时间点上，fFn网络上的CD44+/CD24−/ALDH+亚群也是显著高于控制组的。MDA-MB-468细胞培养4天之后，fFn网络被去细胞化并且针对Fn和层连蛋白共染色。结果证明MDA-MB-468细胞只是分泌了少量的层连蛋白，而原本的fFn网络还是保存完好。证明Fn是早期上皮间质转化的主要ECM因素。

图4. fFn网络扩增病人乳腺癌细胞

最后，作者测试了利用fFn网络直接扩增病人乳腺癌细胞的能力，结果显示8天的时候，fFn支架的扩增数量比对照组高出7倍，且fFn支架可以在体外诱导乳腺癌病人细胞的上皮间质转化。

图5. 3D jet writing

文章中的网格状聚合物支架由Joerg Lahann教授团队之前提出的3D Jet Writing工艺制造，相关文章于2018年发表在Advanced Materials杂志上，题为3D jet writing: functional microtissues based ontessellated scaffold architectures。该工艺的优势在于可以3维高精度地沉积聚合物纤维，且不需要像溶体电纺那样高温加热，为载细胞的高精度电纺打印打下基础。其特点在于在打印喷头的底部安装了一个副电极，抑制了纤维在沉积过程中的不稳定，从而可以实现高重复精度的打印。

参考文献：
[1] Jordahl S, Solorio L, Neale D B, et al. Engineered Fibrillar Fibronectin Networks as Three‐Dimensional Tissue Scaffolds[J]. Advanced Materials, 2019, 31(46): 1904580.
[2] Jordahl J H, Solorio L, Sun H, et al. 3D jet writing: functional microtissues based on tessellated scaffold architectures[J]. Advanced Materials, 2018, 30(14): 1707196.