尽管骨软骨组织工程取得了重大进展，但要成功地重建具有不同空间组成、结构和功能特性的三维类似本源的复杂组织仍是一个挑战。上海交通大学戴尅戎院士团队受细胞外基质(ECM)组成的梯度和原生骨软骨组织中的胶原纤维结构的启发，设计并利用近场直写技术制造了三层：浅表软骨（S），深软骨(D)，和软骨下骨(B)的PCEC分层支架，并在其中填充含有间充质干细胞(MSC)的甲基丙烯酰胺(GelMA)水凝胶与区域特异性生长因子。复合支架在体内同时实现软骨和软骨下骨再生，证明仿生构建模拟自然骨软骨组织的空间变化，并以增强骨软骨组织再生的可行性，相关研究成果“Bioinspired stratified electrowritten fiber-reinforced hydrogel constructs with layer-specific induction capacity for functional osteochondral regeneration”发表于Biomaterials上。
S\D\B的支架使用熔融近场直写技术制造，其中B层不施加电压，用不同的打印参数实现纤维的排列与直径分布区别。载细胞的GelMA水凝胶使用紫外线辅助、逐步渗透并交联，如Figure 1。层特异性纤维排列和生长因子传递的联合作用使层特异性诱导BMSCs表现出与原生骨软骨组织相似的分区细胞表型和ECM组成。此外，S层的加入可以使再生软骨具有更润滑和更耐磨的表面，这对功能性骨软骨再生至关重要。
图1 异质复合结构示意图
异质复合支架的实际打印结果如Figure 2。在PCEC-nHA 支架表面可以观察到少量分散的HA颗粒，这表明HA纳米颗粒已经成功地融入到PCEC支架中。此外，载生长因子的微球和水凝胶中BMP-7、TGF- mik1和BMP-2的累积释放谱显示，GFs可以在3周的孵育时间内持续释放。
图2 支架打印结果，支架力学与细胞生长状态
不同的支架结构在体外构建S、D和B层，诱导软骨形成和成骨相关的分区标记的差异表达，结果如Figure 3。 由于高模量PCEC纤维的增强，本来弱的GelMA水凝胶得到了增强，其压缩模量与天然软骨相当。结果表明mRNA和蛋白表达水平等级具有明显不同，S + G + F组合后的样品诱导带显性标记表达的能力显著增强。
图3 不同的支架配方在体外构建S、D和B层，诱导软骨形成和成骨相关的分区标记的差异表达
Figure 4显示了三层S +G + F结构的分区特异性软骨形成和成骨相关标记蛋白积累和细胞F-肌动蛋白定向。结果表明，开发的三层S + G + F结构可能有希望用于工程空间分层的骨-软骨组织，具有原生细胞定向和带状标记蛋白沉积。
图4 使用S + G + F构建的三层结构使细胞的空间分层定向和区域标记蛋白在体外积累
研究人员将先前实验中表现最好的S + G + F组合支架用于兔骨-软骨缺损模型的修复，如Figure 5。使用单层B、双层B + D和三层B + D + S复合支架进行术后24周缺陷修复的大体观察。结果表明，在缺陷区域引入S层能够提供润滑，减轻关节磨损，并使再生软骨具有光滑的表面。所有被测组在术后6个月的缺损区域显示出相当数量的钙化组织。此外，随着愈合时间的延长，可以观察到骨沉积增强和支架逐渐降解的情况。
图5 体外造软骨成骨效果最好的复合结构组合(S + G + F组合支架)在兔骨-软骨缺损模型中的研究结果
综上，在纤维引导和GF诱导的共同作用下，复合结构表现出良好的诱导间充质干细胞向软骨分化和成骨系分化的能力，并表现出具有空间变化的细胞表型和ECM组成的带状组织三维结构。体内软骨缺损修复实验进一步证实，纤维增强和生长因子加载的三层水凝胶结构可以同时促进软骨和软骨下骨的再生。
论文链接：
https://doi.org/10.1016/j.biomaterials.2020.120385
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