《Biofabrication》：蛋清用做生物墨水？改善3D打印支架的生物学

来源： EngineeringForLife

三维微挤压生物打印在制造具有空间定义的细胞分布的分层结构、功能性组织替代品方面引起了极大的兴趣。尽管取得了相当大的进步，但仍然存在一些重大限制，例如缺乏合适的生物墨水，这些生物墨水将有利的细胞反应与高形状保真度相结合。

为了解决这一局限性，来自德累斯顿工业大学的Michael Gelinsky的团队创新性的设计了蛋清(EW)功能化的藻酸盐-甲基纤维素(AlgMC)混合物的新型生物墨水。生物打印的AlgMC+EW构造表现出出色的形状保真度，而封装的人间充质干细胞(MSC)显示出高打印后活力以及在基质内的粘附和扩散。

相关研究成果以“Egg white improves the biological properties of an alginate-methylcellulose bioink for 3D bioprinting of volumetric bone constructs”为题于2023年2月3日发表在《Biofabrication》上。

1. 不同EW浓度的低粘度Alg水凝胶中的细胞反应
为了研究EW对细胞反应的影响，制备了六种不同的Alg水凝胶组合物，其中 Alg 含量恒定为 3%（w/v），EW 的比例从 0-100% 不等。基于这些生物墨水的载满细胞的圆盘状结构是通过挤压沉积法制造的（图1A）。培养 1 天和 7 天后，通过活/死测定评估制造的载有细胞的圆盘的细胞相容性（图1B），各组细胞存活率均达到80%以上。由此，EW 支持的生物墨水可以促进 MSC 在基于挤压的支架中的活力。

图1 3D打印支架及细胞存活率

此外，与第1天相比，细胞密度有所降低（图2A）。相比之下，在 E40-H60 组中发现了MSC的交错细胞骨架网络，并且在孵育7天后也可以观察到 E60-H40、E80-H20 和 E100-H20 组中的细胞附着和扩散（图2A），即细胞可以在用 EW 修饰的Alg生物墨水中附着和扩散；然而，EW的浓度应超过40%才能产生显着效果。为了进一步分析不同支架中的细胞形态，对培养7天后的细胞面积（细胞骨架染色的覆盖面积）进行了定量测量（图2C）；结果表明含有EW的Alg墨水可以促进MSC在凝胶中的附着和扩散，并且 EW 的量不应低于40%。

图2 不同EW比例的挤压Alg生物墨水中的细胞活力

2. 探索MSC在EW支持的藻酸盐油墨中的活力和附着力，同时增强MC的印刷适性
由于带有EW的Alg墨水（3%，w/v）的低粘度不允许3D打印具有足够形状保真度的线以形成多孔网格状结构，这对于生物打印结构中的开放孔隙率是强制性的，因此作者混合了Alg含MC的油墨，用于增强粘度和印刷适性。根据之前细胞反应结果，作者选择E40-H60和E60-H40混合物（即40%和60% EW浓度）用作生物聚合物Alg和MC的溶剂。相关制备过程示意图如图3A所示，将MSC添加到不同的墨水中以制备生物墨水和挤压结构。

之后通过评估细胞活力和形态对制备的生物墨水中的细胞反应进行初步评估。在培养1天和21天后，通过活/死染色评估MSC在具有不同浓度EW和MC的挤压圆盘结构中的生存能力（图3B）。从这些结果得出的结论是，与不含 MC 的 Alg 凝胶相比，细胞活力随着 MC 的添加而降低。培养21天后，各组均能保持较高的细胞活力；此外，作者还发现细胞可以在结构中附着和扩散（图 3B）。

图3 制备过程示意图及细胞染色的代表性荧光显微图像

为了进一步研究细胞形态，在培养1天和21天后对细胞核和肌动蛋白细胞骨架进行荧光染色，捕获的图像如图4A所示。60% EW组比40% EW组更成功地支持细胞生长，从细胞骨架的形态学分析来看，具有 60% EW 的组表现出更好的细胞粘附和扩散，可能是因为这些材料为 MSC 提供了更多的粘附位点和友好的微环境。根据细胞骨架染色后的显微照片定量分析细胞面积显示，60％EW组的细胞面积大于40％EW组(图4C)。这些结果初步表明，具有60% EW的AlgMC生物墨水在生物打印结构中具有良好细胞反应，表现优于40% EW组。因此，具有60% EW的AlgMC生物墨水用于进一步的实验。

图4 不同比例的MC和EW的生物打印Alg-MC-EW结构中MSC的细胞活力

3. 流变学特性
流变学特性是对糊状生物材料的印刷适性具有决定性影响的物理化学参数，基于开发的油墨的生物学特性评估结果，油墨组合物 60-40(3-3)、60-40(3-6) 和 60-40(3-9) 的流变学特性为通过剪切斜坡和剪切恢复试验进行研究。通过将 MC 浓度从 3% 增加到 9%，a在 0 到 100 s−1 的剪切速率范围内实现了粘度的稳定增加，同时所有组也表现出出色的剪切稀化行为（图5A）。

通常，较高的粘度会导致较高的印刷保真度，这意味着 MC 可以用作增强水凝胶油墨粘度并提高其印刷保真度的补充剂。结果表明，开发的油墨在暴露于交替的高剪切应力和低剪切应力时具有恢复其弹性的能力，这意味着它们具有良好的形状保持特性，适用于基于挤出的印刷。此外，还可以发现高压灭菌对制备的油墨的流变学性能没有不利影响，因此可以看作是一种方便有效的海藻酸盐和甲基纤维素灭菌方法。

图5 添加细胞悬液前后的油墨流变学特性

4. 基于蛋清支持油墨的复杂3D结构的可印刷性和构建特性
通过手动制作圆盘状支架来评估EW支持的生物墨水的可挤出性及其形成稳定链的能力。在所有组中均观察到良好的可挤出性，并且可以形成连续长丝（根据其特定粘度和挤出行为调整印刷压力）。作者从流变测量、灯丝塌陷（图6A）和融合测试（图6B）的结果得出结论，60-40(3-9) 和 HBSS(3-9) 墨水在 3D 支架制造中表现出出色的可印刷性和形状保真度。作者进一步探索了包含具有挑战性的几何特征的复杂体积结构的3D打印，以研究这种新型电子战墨水的自支撑能力（图6C）。所有结构都保持其形状和设计特征，具有开放和相互连接的大孔，这对于细胞输送氧气和营养以及代谢副产物非常重要。此外，更复杂、体积更大的结构具有更具挑战性的特征（例如打印了解剖形状、动物模型和曲线交织多孔结构）（图6D-H）。

图6 复杂3D结构的可印刷性和构造特征

5. 3D打印AlgMC+EW支架的细胞相容性
为了评估3D打印AlgMC+EW墨水的接种hTERT-MSC的细胞活力和粘附行为，将支架培养1、4和7天，并对活/死细胞活力进行染色。支架上活/死染色细胞的荧光图像、细胞活力和粘附率的定量分析如图7A-C所示。AlgMC+EW 支架中的细胞密度高于AlgMC组（图7C），表明AlgMC+EW支架为MSC提供更具吸引力的环境。AlgMC+EW 支架上的细胞则相反，明显扩散并附着在支架表面（图7A），这也导致粘附率增加（图7C）。与此同时，几乎所有的活细胞都显示出足够的粘附水平，它们散布在支架的表面并伸展以与相邻的细胞连接，表现出丝状伪足样的延伸。此外，计算出的细胞粘附率进一步增加，明显高于AlgMC组（图7C）。

图7 无细胞AlgMC+EW支架的制备及3D打印支架的细胞相容性评价

6. AlgMC+EW支架中人原代前成骨细胞(hOB)的成骨分化
为了进一步研究 EW 对成骨分化的影响，将从骨关节炎患者的人股骨头中分离出来的hOB悬浮在 AlgMC + EW 生物墨水中以制造载有 hOB 的支架；同时，载有hOB的普通 AlgMC 支架作为对照组进行了生物打印（图8A）。AlgMC+EW墨水中的大部分hOB显示出具有高细胞密度的细长形态，而在AlgMC支架中仍观察到球形。此外，对支架中的细胞核和细胞骨架进行荧光染色，以进一步观察第1、21和28天的细胞形态。而AlgMC支架中的细胞仍然小而圆，只有少数细胞表现出轻微的细长细胞形态；类似的结果一直保持到第28天。此外，图8D说明AlgMC+EW 支架内的细胞数量明显高于AlgMC。这些结果表明 EW 具有促进 hOB 细胞粘附、扩散、迁移和增殖的功能（图8）。在成骨培养基中培养后，这种效果甚至会增强，这可能是由于基于EW的生物墨水中存在蛋白质，它为细胞附着提供了整合素结合基序。

图8 3D支架的制备过程以及AlgMC和AlgMC+EW支架的细胞表征

综上，本文开发了一种新型生物墨水，其优化配方由海藻酸盐、甲基纤维素和蛋清 (EW) 组成，它结合了良好的印刷适性和高形状保真度以及良好的细胞反应。为了研究添加EW对成骨分化的影响，在AlgMC+EW生物墨水中对人原代前成骨细胞(hOB)进行了生物打印。它们显示出hOB的高活力(93.7 ± 0.2 %) 和随培养时间的粘附，以及生物墨水内的增殖和迁移。与无 EW 支架相比，部分成骨标记物（IBSP、BGLAP）的基因表达也得到了促进。

文章来源：
https://doi.org/10.1088/1758-5090/acb8dc