《Biofabrication》：源于GelMA墨水，打印肿瘤类器官

来源： EngineeringForLife

3D体外肿瘤模型对癌症生物学特征研究和药物开发至关重要。但是目前模拟肿瘤微环境仍然具有难度，因为肿瘤微环境是由各种细胞成分和生物因素组成的异质性混合物。用于肿瘤组织工程的水凝胶材料缺乏相关物理性相互作用，无法将细胞释放的生物活性因子保持在水凝胶内并改善旁分泌的相互作用。近日，来自美国寺崎生物医学创新研究所Bingbing Li、Hanjun Kim、Ali Khademhosseini教授团队进行了用于3D生物打印类器官肿瘤模型的甲基丙烯酰化明胶和皂石生物墨水的相关研究。研究成果以“Gelatin methacryloyl and laponite bioink for 3D bioprinted organotypic tumor modeling”为题于6月22日发表在《Biofabrication》上。


本文从以下6方面进行系统表征：

1. GelMA/Laponite复合水凝胶可打印性评估

2. 非交联GelMA/Laponite复合水凝胶可注射性和流变学评估

3. 载有细胞的GelMA/Laponite复合生物墨水体外生物相容性评估

4. 载有细胞的GelMA/Laponite复合生物墨水体外细胞形态学评估

5. 使用GelMA/Laponite复合生物墨水进行高通量制造三维生物打印的胰腺癌类肿瘤模型

6. 三维生物打印胰腺癌类肿瘤模型基因和蛋白质表达分析

图1 实验流程示意图

本研究开发了一种纳米工程离子共价交联的生物墨水，构建3D生物打印类器官肿瘤模型。该生物墨水创造了一个由明胶（GelMA）和合成纳米硅酸盐（Laponite）组成的相互渗透网络，Laponite是轻度交联的聚合物，具有独特的离子特性，可以促进细胞释放的生物因子保留，并协助旁分泌信号传导。低GelMA（5%）与高Laponite（2.5-3.5%）复合水凝胶和高GelMA（10%）与低Laponite（1.0-2.0%）复合水凝胶3D打印机械性能都在可接受范围内。但是高Laponite含量的低GelMA复合水凝胶无法提供细胞生存能力。随着Laponite比例的增加，细胞更加聚集，形成更大的3D肿瘤结构。RT-qPCR和Western blot实验显示，Laponite比例的增加会诱导肿瘤细胞中生长因子和组织重塑相关基因以及蛋白质的上调。相反，细胞周期和增殖相关的基因下调。另一方面，对于成纤维细胞，Laponite比率的增加也会导致与间质相关的基因和蛋白质整体上调。

图2 GelMA/Laponite复合水凝胶可打印性表征

在基于挤压的生物打印过程中，由于内喷嘴直径、压力、打印速度、温度和促凝剂成分等可以控制和影响打印纤维形态。作为优化生物打印过程的第一步，设定了喷嘴压力（30G）、温度（23℃）和打印速度（5毫米/秒）。改变GelMA/Laponite水凝胶的成分，控制打印压力（50kPa到 80千帕）。将单层结构打印在聚苯乙烯培养皿上，光学显微镜成像显示随着Laponite比例的增加，打印出的GelMA/Laponite纤维整体厚度和形状都在不断变化。接着，评估了复合水凝胶的可打印性。在0.0-3.5%Laponite与两种GelMA比例（5%，10%）之间，当GelMA的百分比较低（5%），而Laponite的含量低于2.0%时，粘性就会降低。而低于2.0%时，粘度太低，无法保持几何形状。另一方面，当GelMA百分比较高（10%），而Laponite的百分比超过2.5%时，粘度过高，无法挤出。进行打印保真度、物理和化学特性（如流体力学、硬度、溶胀性和降解等）分析都显示出Laponite对3D生物打印具有积极影响。

图3 载有细胞的GelMA/Laponite复合水凝胶体外生物相容性以及胰腺癌细胞混入凝胶后形态学

研究人员为了建立一个癌细胞和基质细胞共存类器官肿瘤模型，使用含有肿瘤细胞和基质细胞的GelMA/Laponite复合水凝胶进行3D生物打印。接着通过活/死细胞染色（直接存活率）和代谢活动（间接线粒体）来分析了MIA PaCa-2细胞在水凝胶内的存活率，培养7天和10天后，复合水凝胶组之间细胞增殖出现差异，但是所有组中都有大量活力旺盛的细胞。高Laponite含量的G5Lx组比单纯G5Lx组有相对较少的活细胞。G10Ly组的细胞在3D生物打印结构内增殖长达7天，形成细胞聚集团。而G5Lx组有较少的细胞，而且以分散和不连续的方式分布。10天后进行线粒体活性分析发现Laponite会影响细胞生长。6%的Laponite生物墨水可用于3D生物打印小鼠成骨细胞系，并保持7天活力。因此基于Laponite的支架可以作为组织工程的骨架使用。

总结与展望
本文开发了一种纳米离子共价交联的生物墨水，用来构建3D生物打印类器官肿瘤模型。Laponite通常用做组织工程中剪切稀化的材料，具有独特的离子电荷，可以增加组织工程中释放的生物因子的保留率，并协助旁分泌信号的产生。本研究结果中，复合水凝胶与低Laponite具有较高的生物相容性，改善了流体学和机械性能。此外GelMA/Laponite水凝胶有效促进了MIA PaCa-2细胞和成纤维细胞的增殖，提供了一个较好的微环境。Laponite比率的变化会导致肿瘤相关基因和成纤维细胞相关基因的mRNA表达水平的显著变化。GelMA/Laponite复合生物墨水引起癌细胞的微环境重塑，并导致基因的上调，这些基因可以促进脱髓鞘成纤维细胞和CM在3D生物打印类器官肿瘤模型积累。总之GelMA/Laponite复合水凝胶的机械性能可以进行打印，同时该体系能改善肿瘤细胞/间质细胞的相互作用，促进细胞的生存、增殖和发展。该研究未来将大力促进类器官肿瘤模型的构建。

文章来源：
https://iopscience.iop.org/article/10.1088/1758-5090/ace0db