体外多孔肝癌模型的3D生物打印：建立、评价和抗癌药物测试

来源：生物设计与制造

传统的肿瘤模型往往不能准确地模拟体外肿瘤生长或实现个性化治疗，特别是无法发现更有益的靶向药物。为了解决这个问题，本研究描述了利用三维(3D)生物打印技术，通过将甲基丙烯酸明胶(GelMA)和聚环氧乙烷(PEO)作为两种不混溶的材料作为生物墨水，并创新地应用荧光碳量子点对细胞进行长期跟踪，构建了人肝癌SMMC-7721细胞体外肿瘤模型(3DP- 7721)。体积比为3:1的GelMA(10%，质量分数)和PEO(1.6%，质量分数)水凝胶具有明显的成孔特性，令人满意的力学性能和生物相容性，可用于创建3DP -7721模型。采用免疫荧光法和定量实时荧光聚合酶链反应(PCR)评价模型的生物学特性。与二维培养细胞模型(2D-7721)和三维混合培养细胞模型(3DM-7721)相比，3DP -7721模型显著提高了细胞的增殖能力以及肿瘤相关蛋白和基因的表达。此外，我们评估了三种培养模型之间的差异以及三种模型中抗肿瘤药物的有效性，发现三种模型之间的抗肿瘤药物的有效性存在差异，这是因为三种模型之间的耐药蛋白和基因存在显著差异。此外，比较三种模型的成瘤情况发现，3DP -7721模型培养的细胞对裸鼠具有较强的致瘤性。免疫组化评价实体瘤形成相关生化指标水平显示，3DP -7721模型组表现出恶性肿瘤病理特征，生成的实体瘤与实际肿瘤相似，恶化程度更高。本研究为3DP -7721模型在药物开发研究中的应用奠定了基础。

图1 实验过程及检测流程图。(a) 生物墨水组成、3D打印工艺和结构交联示意图；(b) 建立2D-7721、3DM-7721和3DP -7721模型进行耐药评价的比较。SMMC-7721：人肝癌细胞；3D：三维；2D-7721：二维培养模型；3DM-7721：3D混合培养模型；3DP -7721：3D生物打印模型；GelMA：甲基丙烯酸明胶;PEO:聚环氧乙烷；CDs：碳量子点

图2 GelMA体积比 (10%，质量分数) 与PEO体积比 (1.6%，质量分数) 对孔隙大小有不同的影响。(a-e) 不同GelMA与PEO体积比下罗丹明b染色多孔水凝胶结构的荧光显微图和(f-i) 粒径分布直方图。GelMA：甲基丙烯酸明胶；PEO：聚环氧乙烷

图3 多孔水凝胶结构的 (a) 应力-应变曲线和 (b) 杨氏模量。不同体积比下GelMA和PEO的溶胀率和孔隙率。数据以均数±标准差表示，n=3.*p<0.05， **p<0.01， **p<0.001。GelMA：甲基丙烯酸明胶；PEO：聚环氧乙烷

图4 打印参数优化。不同打印速度和压力(1 bar = 100 kpa)下的打印全景图。比例尺：3 mm, n=5

图5 3D生物打印肝癌细胞模型中肝脏相关蛋白的表达。图中为3DP -7721模型打印7 d后AFP、Ki67、CYP3A4、ALB的表达情况。比例尺:300 μm。n = 3。3D：三维；ALB：白蛋白；AFP：甲胎蛋白；Ki67：增殖标记蛋白Ki-67；CYP3A4：细胞色素p450氧化酶家族成员；3DP -7721：3D生物打印模型；DAPI：4,6 -二氨基-2-苯基吲哚；CDs：碳量子点

图6 生物3D打印肝癌细胞模型中mRNA的表达。第1、5、10、15天2D-7721、3DM-7721和3DP -7721模型中肿瘤相关蛋白和基因的mRNA表达，包括(a) AFP、(b) TGF-β、(c) EpCAM、(d) CD133、(e) IL-8和 (f) CD24。数据以均数±标准差表示，n=3。0.05， **p<0.01， **p<0.001。3D：三维；2D-7721：二维培养模型；3DM-7721：3D混合培养模型；3DP -7721：3D生物打印模型；AFP：甲胎蛋白；TGF- β：转化生长因子；EpCAM：上皮细胞粘附分子；CD133：prominin-1；IL-8：白介素-8；CD24：分化簇24

图7 (a) 3DP -7721模型中SMMC-7721细胞与不同浓度DOX孵育24 h的荧光成像。比标条:300 μm。(b) DOX、(c) 木犀草素、(d) 顺铂在2D-7721、3DM-7721、3DP -7721模型治疗48 h后的剂量效应曲线。数据以均数±标准差表示，n=4。SMMC-7721：人肝癌；CDs：碳量子点；DOX：盐酸阿霉素；2D-7721：二维培养模型；3DM-7721：三维混合培养模型；3DP -7721：3D生物打印模型；IC50：最大抑制浓度的一半

图8 2D- 7721、3DM-7721和3DP -7721模型耐药蛋白和耐药基因mRNA表达情况。(a) MRP1, (b) BCRP, (c) MDR-1, (d) MRP2, (e) ABCB1, (f) EGFR mRNA表达。数据以均数±标准差表示，n=3。*P<0.05， **p<0.01， **p<0.001。2D-7721：二维培养模型；3DM-7721：三维混合培养模型；3DP-7721：3D生物打印模型；MRP1：多药耐药相关蛋白1；BCRP：乳腺癌耐药蛋白；MDR-1：多药耐药1；MRP2：多药耐药相关蛋白2；ABCB1：atp结合盒亚家族b成员1基因；EGFR:表皮生长因子受体

图9 不同模型细胞的致瘤性。裸鼠 (b) 肿瘤(2D-7721、3DM-7721和3DP -7721培养组)形成肿瘤后21天的照片。(c) 第21天肿瘤重量。数据以均数±标准差表示，n=3。*p<0.05。(d) 不同模型各时间点小鼠体重和 (e) 肿瘤体积。(f) 不同模型实体瘤HE、Ki67、EpCAM、CD133、TUNEL染色结果。2D-7721：二维培养模型；3DM-7721：三维混合培养模型；3DP -7721：3D生物打印模型；HE：苏木精和伊红；Ki67：增殖标记蛋白Ki-67；EpCAM：上皮细胞粘附分子；CD133：prominin-1；TUNEL：末端脱氧核苷酸转移介导dutp -生物素缺口末端标记试验