来源： EngineeringForLife
肌腱连接处（MTJ）是位于肌肉和肌腱交界处的一种复杂而特殊的组织，负责将力量从收缩的骨骼肌通过肌腱传递到骨骼。作为肌肉和肌腱的交界处，MTJ 在日常运动或锻炼中的重复负荷下承受着集中的机械应力，因此，MTJ 的损伤非常普遍。据报道，28% 的肌肉-肌腱-骨骼复合体损伤发生在 MTJ，其风险在肌肉、肌腱、肌肉-肌腱界面和肌腱-骨骼界面损伤中位居第二。目前临床上治疗 MTJ 损伤的方法包括非甾体抗炎药和物理疗法等保守疗法，以及使用各种缝合技术进行手术干预。然而，其有效性受到以下几个方面的限制：(i)瘢痕组织的形成导致机械强度不足，导致治疗后复发率较高；(ii)MTJ 损伤处或附近的缝合切口，经常导致 MTJ 重建失败；(iii)大面积 MTJ 缺损的修复具有挑战性，尤其是在肌肉和肌腱损伤后回缩的情况下。因此，目前的干预措施无法同时促进 MTJ 的结构和功能修复，因此有必要开发前景广阔的高质量 MTJ 再生策略。
来自南京医科大学的姚庆强团队与来自东南大学的张薇等团队合作开发了一种含有间充质干细胞和 Klotho 的3D打印生物活性纤维增强水凝胶，用于 MTJ 的结构和功能再生。在大鼠MTJ缺损模型中，生物活性纤维增强水凝胶促进了肌肉、肌腱和肌肉-肌腱界面的结构恢复，并增强了损伤MTJ的功能恢复。体内蛋白质组学和体外细胞培养阐明了生物活性纤维增强水凝胶通过调节氧化应激和炎症反应的再生机制，从而设计出一种优化的微环境来支持移植间充质干细胞的存活和分化，并维持 MTJ 组织内常驻细胞（包括肌腱/肌肉细胞和巨噬细胞）的功能表型。这种策略为治疗 MTJ 损伤提供了一种前景广阔的方法。相关工作以题为“Bioactive fiber-reinforced hydrogel to tailor cell microenvironment for structural and functional regeneration of myotendinous junction”的文章发表在2024年04月24日的国际顶级期刊《Science Advances》。
1. 创新型研究内容
本研究开发了一种3D打印纤维增强多功能水凝胶，为MTJ的结构和功能再生提供足够的机械支持和定制合适的微环境（图1A）。在这种生物活性纤维增强水凝胶系统中，3D打印聚（乳酸-共聚-乙醇）酸（PLGA）支架具有良好的排列结构，可为MTJ的生理功能提供足够的机械强度；间充质干细胞的引入可增强肌肉和肌腱的促再生生物活性，Klotho的负载可改善MTJ损伤后外源性间充质干细胞和内源性MTJ驻留细胞的病理环境；此外，将光交联甲基丙烯酰丝纤维素（SilMA）水凝胶融合到 PLGA 支架中，作为输送 Klotho 的载体，并为间充质干细胞的保留和存活提供3D富水微环境。本研究首先评估了生物活性纤维增强水凝胶的理化性质和细胞相容性。随后，将水凝胶系统植入大鼠 MTJ 缺陷模型，以评估其在促进 MTJ 结构和功能再生方面的原位功效。进行了体内蛋白质组学分析，以揭示水凝胶系统促进 MTJ 再生的内在机制。根据蛋白质组学结果，进行了进一步研究，探讨通过水凝胶系统操纵细胞微环境是否以及如何调节移植间充质干细胞和常驻细胞的行为，从而促进 MTJ 再生。
【制备生物活性纤维增强水凝胶并对其进行表征】
为MTJ再生设计一种具有足够机械强度和再生生物活性的理想组织工程支架，本研究开发了一种负载间充质干细胞和 Klotho 的 PLGA 纤维增强 SilMA 水凝胶（图 1A）。利用熔融沉积建模（FDM）3D打印技术，制作了具有正交排列网格和相互连接的大孔的 PLGA 支架，为受伤的 MTJ 的力传导和组织生长提供机械和结构支持。随后，将 SilMA 前体、间充质干细胞和重组 Klotho 的混合物融合到 PLGA 支架中，并通过光交联形成具有微孔和互连结构的纤维增强水凝胶。作为间充质干细胞和生物活性分子的多功能载体，SilMA 水凝胶的引入提高了间充质干细胞的保留率，为细胞生长和营养交换建立了有利的3D微环境，并有效地充当了 Klotho 的释放系统。扫描电子显微镜（SEM）图像显示，微孔 SilMA 水凝胶渗入大孔 PLGA 支架的间隙中，从而提供了有利于细胞粘附的更佳微环境（图 1B）。PLGA（PA）、SilMA-PLGA（SM-PA）和 Klotho@SilMA-PLGA （K@SM-PA）支架的 PLGA 纤维直径约为 340 μm（图 1C）。此外，SM-PA 和 K@SM-PA 支架的孔面积没有明显差异，表明 Klotho 的加入对 SilMA 水凝胶的微孔结构没有显著影响（图 1D）。对播种了间充质干细胞的纤维增强水凝胶进行的扫描电镜分析表明，间充质干细胞以球形或纺锤形形态包埋在 SilMA 水凝胶基质中。
图1 生物活性纤维增强水凝胶的制造与表征
【生物活性纤维增强水凝胶能有效促进大鼠 MTJ 的结构和功能再生】
利用大鼠 MTJ 缺损模型评估了本研究的生物活性纤维增强水凝胶对 MTJ 再生的功效（图 2A）。未经处理的 MTJ 缺损设为对照组。植入 4 周后，对 MTJ 缺损处的再生组织进行组织学检查。结果发现，术后 4 周时，残留支架占据了再生组织的一定空间，阻碍了典型 MTJ 结构的清晰呈现。因此，位于缺损处和邻近支架的修复组织被用来评估 MTJ 修复情况。血红素和伊红（H&E）以及马森三色染色显示，M@SM-PA 组和 K/M@SM-PA 组再生的 MTJ 组织显示出肌肉和肌腱纤维的广泛插入，并有明显的相互交错，而 Ctrl 组和 SM-PA 组的组织则显示出罕见、不规则和短的相互交错（图 2B 和 C）。还观察到 M@SM-PA 和 K/M@SM-PA 水凝胶比 Ctrl 和 SM-PA 支架能诱导形成更有组织的肌腱纤维，K/M@SM-PA 组的肌腱胶原纤维呈原生波浪状（图2B 和 C）。定量分析显示，与其他三组相比，K/M@SM-PA 组的肌腱组织学评分明显较低，表明其形成的组织更像肌腱（图 2G）。在再生肌肉组织方面，K/M@SM-PA 组与 Ctrl、SM-PA 和 M@SM-PA 组相比，肌纤维直径明显增加，表明 K/M@SM-PA 水凝胶促进了肌肉再生（图 2B、C 和 H）。总之，这些发现意味着生物活性纤维增强水凝胶在促进 MTJ 组织形成和重塑方面具有很高的功效。
图2 生物活性纤维增强水凝胶可促进大鼠 MTJ 的结构再生
本研究通过步态分析和机械测试进一步评估了修复后 MTJ 的功能恢复情况。步态分析是通过评估行为表型来评估 MTJ 功能的一种可行且无创的方法。如图 3A 至 C所示，使用实时荧光成像系统捕捉大鼠行走时的爪印。在指定时间点（术后 1 周、2 周和 4 周）收集大鼠爪印并对步态参数进行综合分析，包括时空参数（步长、摆动时间和摆动速度）和强度参数（平均强度、最大接触平均强度和最大接触最大强度）（图 3D 和 E）。随着疼痛程度的增加，大鼠的行走运动受到不利影响，导致除摆动时间外的所有上述参数下降。结果显示，与正常大鼠相比，术后 1 周所有组大鼠的步态均出现异常，步长和步幅明显减少（图 3F 和 I 至 K）。从第 1 周到第 4 周，这些参数逐渐接近甚至超过正常大鼠，其中 K/M@SM-PA 组的恢复最为明显（图 3F 至 K）。具体来说，术后第 2 周，K/M@SM-PA 组的步长和摆动速度值明显高于 Ctrl 组（P < 0.05）（图 3F 和 H）。此外，K/M@SM-PA 组大鼠的摆动速度值在术后 2 周已超过正常大鼠（图 3H）。在摆动时间方面，K/M@SM-PA组大鼠在术后1周和2周的摆动时间值最低，表明K/M@SM-PA水凝胶治疗后大鼠的行走运动得到了改善，但组间差异不显著（图3G）。此外，K/M@SM-PA 组的强度参数在所有组别中表现出最高水平，包括术后 4 周的平均强度、最大接触平均强度和最大接触最大强度（图 3I 至 K）。这表明，K/M@SM-PA 治疗后，大鼠的站立姿势更加稳定，疼痛减轻。总之，上述步态分析表明，在植入生物活性纤维增强水凝胶后，MTJ 的功能恢复得到了显著改善。
图3 生物活性纤维增强水凝胶促进大鼠 MTJ 的功能恢复
【体内蛋白质组学揭示生物活性纤维增强水凝胶促进 MTJ 再生的内在机制】
为阐明K/M@SM-PA促进MTJ再生的机制，对术后2周的再生MTJ组织进行了体内无标记蛋白质组学分析。对来自 M@SM-PA 组和 K/M@SM-PA 组的三个独立重复序列进行了测序，聚类分析后的差异表达蛋白（DEPs）热图显示，这两组之间的蛋白表达量存在显著差异（图 4A）。主成分分析（PCA）显示，每组的三个重复品都有明显的聚类（图 4B）。如火山图所示，共鉴定出 937 个蛋白质，其中有 193 个上调的 DEPs 和 553 个下调的 DEPs（K/M@SM-PA 与 M@SM-PA）（图 4C）。为深入了解这些DEPs的功能，研究人员进行了基因本体（GO）富集分析，以揭示发生变化的生物过程（BPs）、细胞成分（CCs）和分子功能（MF）。如图 4D 所示如图 4D 所示，上调的 DEPs（K/M@SM-PA 与 M@SM-PA）富集了几个与 MTJ 再生高度相关的 GO 术语，包括 BP 中的 “肌肉系统过程”、“横纹肌收缩”、“骨骼肌收缩”、“肌肉结构发育”和“骨骼肌组织发育”；CC 中的“肌球蛋白复合物”、“锚定连接”、“局灶粘附”和 “肌肉-肌腱连接”；以及 MF 中的“肌肉α-肌动蛋白结合”。这些术语大多与骨骼肌的发育和功能维持有关，表明在纤维增强水凝胶系统中加入Klotho能有效促进MTJ缺损中骨骼肌的再生，这与组织学结果一致（图2B、C、F、H和K）。对上调的 DEPs 进行的 BinGO 分析也显示了一致的结果。还发现了几个与肌肉-肌腱界面相关的 CC 术语，包括“锚连接”、“局灶粘附”和“肌腱连接”（图 4D），这可能与 MTJ 标记表达上调和肌肉-肌腱整合改善有关（图 2，D 和 I）。在这些术语中，“局灶粘附”和“锚连接”是 MTJ 的关键组成部分。它们与肌球蛋白的肌动蛋白丝相连，肌动蛋白丝附着在细胞外的层粘连蛋白上，促进了肌纤维与肌腱 ECM 的锚定。然而，可能由于缺乏足够的肌腱特征标记物，没有肌腱特异性术语被富集。为克服 DEP 富集分析的局限性，还对所有鉴定出的蛋白质进行了基因组富集分析（GSEA）。结果显示，在比较 K/M@SM-PA 和 M@SM-PA 时，多个与肌肉相关的 BP、CC 和 MF 术语发生了显著变化（图 4E），证实了 Klotho 在促进肌肉再生方面的显著作用，这与之前的报道一致。
图4 体内全局蛋白质组学揭示了生物活性纤维增强水凝胶促进 MTJ 再生的内在机制
【生物活性纤维增强型水凝胶可促进细胞存活并支持移植间充质干细胞的成腱/成肌分化】
为证实 Klotho- 加入生物活性纤维增强水凝胶对间叶干细胞存活的保护作用，在体外应用 H2O2 和 IL-1β 刺激诱导细胞氧化应激，模拟损伤 MTJ 的病理环境。采用 2′，7′-二氯荧光素-二乙酸酯（DCFH-DA）测定和定量聚合酶链反应（qPCR）来评估水凝胶系统的抗氧化活性。间充质干细胞经H2O2或IL-1β处理后，H2O2-或IL-1β处理组的ROS阳性细胞较Ctrl组（未经H2O2或IL-1β处理）显著增加，证实H2O2和IL-1β处理能有效促进ROS生成并诱导间充质干细胞氧化应激（图5A和B）。代表性图像和定量分析显示，H2O2/IL-1β + K@SM-PA 水凝胶处理的间充质干细胞在 H2O2- 和 IL-1β 诱导的 ROS 模型中的 ROS 阳性细胞率分别为 11.71 ± 0.77% 和 23.02 ± 7.63%，明显低于 H2O2/IL-1β 处理的间充质干细胞（H2O2-94.15±1.56%，P＜0.0001；IL-1β为96.67±0.68%，P＜0.0001）和H2O2/IL-1β+SM-PA水凝胶（H2O2为86.05±5.86%，P＜0.0001；IL-1β为96.91±1.93%，P＜0.0001）（图5A和B）。
qPCR结果显示，H2O2刺激后，超氧化物歧化酶-1（SOD-1）、锰依赖性超氧化物歧化酶（MnSOD，又称SOD-2）和过氧化氢酶（CAT）的表达水平在H2O2组和H2O2+SM-PA组明显升高（图5C至E），表明间充质干细胞受到的氧化应激增加，激活了其内在的抗氧化防御系统。这与之前的一项研究一致，该研究用各种促氧化剂（包括 H2O2、百草枯和甲萘醌）处理 C2C12 肌肉细胞系，发现 C2C12 细胞会激活抗氧化防御系统以应对氧化应激，表现出几种抗氧化酶的表达显著增加，包括 MnSOD、CAT、Cu/Zn-超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶。相比之下，与 H2O2 组和 H2O2 + SM-PA 组相比，H2O2 + K@SM-PA 组的间充质干细胞在 Klotho 处理后受到的氧化应激水平较低（图 5C 至 E），SOD-1、SOD-2 和 CAT 的表达明显降低就是证明。这些结果表明，负载有 Klotho 的纤维增强水凝胶具有显著的抗氧化生物活性，能有效清除病理微环境中的 ROS。
图5 生物活性纤维增强水凝胶通过抑制氧化应激提高细胞存活率并支持间充质干细胞分化
【生物活性纤维增强水凝胶通过抑制氧化应激维持肌母细胞和肌腱干细胞的表型】
本研究的体内蛋白质组学数据显示，K/M@SM-PA水凝胶可以抑制氧化应激和炎症反应，从而维持内源性和外源性细胞的表型和功能，启动MTJ的再生过程（图4）。除了移植的间充质干细胞外，MTJ 内的常驻细胞群也能对生物活性纤维增强水凝胶改善的微环境做出反应，从而启动 MTJ 再生的细胞过程。鉴于生物活性纤维增强水凝胶对移植间充质干细胞的抗氧化作用已得到证实，本研究将评估范围扩大到分别代表肌肉和肌腱组织内细胞的 C2C12 细胞和肌腱干/祖细胞（TSPCs）（图 6A）。同样，C2C12和TSPCs受到H2O2和IL-1β的刺激，并进行DCFH-DA检测以评估细胞内的ROS。当用 H2O2/IL-1β 和 H2O2/IL-1β + SM-PA 处理时，C2C12 和 TSPCs 表现出的 ROS 阳性细胞数量明显高于对照组，证实了这两种细胞中氧化应激的成功诱导（图 6B 至 E）。研究发现，与 H2O2 + SM-PA 组相比，H2O2 + K@SM-PA 组的两类细胞的 ROS 生成量都大大降低（图 6B 和 C）。C2C12（1.77 ± 1.26% 对 17.44 ± 2.78%，P < 0.05）和 TSPCs（4.66 ± 2.11% 对 55.27 ± 9.93%，P < 0.0001）中的 ROS 阳性细胞率均有所下降（图 6F 和 G）。此外，在IL-1β刺激模型中，在C2C12和TSPCs中也观察到了类似但更显著的效果，与SM-PA水凝胶相比，K@SM-PA水凝胶中C2C12（1.42±0.61%对22.33±3.76%，P＜0.001）和TSPCs（3.80±2.01%对67.28±7.53%，P＜0.0001）的ROS阳性细胞率显著降低（图6D、E、H和I）。这些结果共同证实了所开发的纤维增强水凝胶对肌肉和肌腱系细胞具有很强的抗氧化能力。
图6 生物活性纤维增强水凝胶通过抑制氧化应激维持 C2C12 和 TSPC 的功能表型
【生物活性纤维增强水凝胶引导巨噬细胞从促炎表型极化为抗炎表型】
本研究采用了常用的 M1 型巨噬细胞极化诱导剂脂多糖（LPS）（图 7A）。IF 染色显示，与 Ctrl 组相比，LPS 刺激可显著上调巨噬细胞中诱导型一氧化氮合酶（iNOS）（M1 标志物）的表达水平（P < 0.01），而 CD206 和精氨酸酶-1（ARG-1）（M2 标志物）的表达则明显下降，证实了 LPS 诱导后巨噬细胞的 M1 极化（图 7B 至 E）。与 LPS 组（P < 0.05）和 SM-PA 组（P < 0.05）相比，K@SM-PA 组的 iNOS 蛋白表达水平大幅下降（图 7B 和 E）。相反，与 LPS 组和 SM-PA 组相比，K@SM-PA 组 M2 标志物（CD206 和 ARG-1）的蛋白表达明显升高，如图 7（C 至 E）所示。与此相一致，本研究发现 K@SM-PA 水凝胶可部分减轻 LPS 刺激后 CCR-7 表达的增加，而 SM-PA 水凝胶则不能（图 7F）。同时，与 LPS 组（P < 0.05）和 SM-PA 组（P < 0.05）相比，K@SM-PA 水凝胶诱导的 CD206 表达量明显增加（图 7F）。IL-10的表达也有类似的趋势，但没有显著差异（图7F）。总之，这些结果表明，Klotho负载的纤维增强水凝胶通过引导巨噬细胞从M1表型极化到M2表型发挥了抗炎作用。
图7 生物活性纤维增强型水凝胶引导巨噬细胞从 M1 表型极化到 M2 表型
本研究开发了一种纤维增强水凝胶，它能为力传导提供足够的机械支持，同时具有免疫调节和抗氧化生物活性，以改善具有挑战性的损伤后微环境，最终调节外源性和内源性细胞的行为，促进体内 MTJ 的结构和功能再生（图 8）。3D打印的 PLGA 支架的排列结构使水凝胶系统具有接近于原生 MTJ 的强大机械性能，可有效支持肌肉-肌腱界面的力传递，从而维持 MTJ 再生过程中的生理功能。在水凝胶系统中加入 Klotho 可减轻氧化应激和炎症反应，从而创造一个有利于再生的微环境，保护 MTJ 损伤中各种细胞群的功能和表型。它能提高移植间充质干细胞的存活率，并支持其多向分化能力，可能有助于在随后的肌肉和肌腱再生过程中增强肌源性/腱源性分化。此外，改善的微环境还能维持 MTJ 中常驻肌腱/肌肉细胞的功能表型，并调节巨噬细胞向抗炎表型的极化。
图8 促进 MTJ 再生的生物活性纤维增强水凝胶示意图
2. 总结与展望
本研究开发了一种生物活性纤维增强水凝胶，它具有足够的机械强度、抗氧化和免疫调节生物活性、干细胞递送特性和内源性细胞调节功能，可同时促进MTJ的结构和功能再生。在这种水凝胶系统中，带有排列整齐纤维的3D打印聚乳酸（PLGA）支架赋予了水凝胶足够的机械强度，以维持 MTJ 的生理功能。由于 Klotho 的加入抑制了氧化应激，该支架为移植间充质干细胞的存活和分化提供了有利的微环境，同时保持了 TSPCs 和肌母细胞的功能表型特征，从而启动了 MTJ 的再生过程。此外，它还具有免疫调节功能，能使巨噬细胞从促炎的 M1 表型恢复到抗炎的 M2 表型。与以往主要在体外进行的 MTJ 组织工程研究不同，本研究定制了一个优化的细胞微环境，以调节体内不同的细胞群，从而增强 MTJ 的结构修复和功能恢复。本研究获得的启示为未来治疗 MTJ 损伤带来了巨大希望。
文章来源：
https://www.science.org/doi/10.1126/sciadv.adm7164
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