来源：EFL生物3D打印与生物制造
在骨修复领域，当前面临着重大挑战。骨具有复杂的层次结构和多孔网络，其再生过程呈现出时间和空间的复杂性，涉及多个阶段及同步的生物过程。然而，大多数骨修复材料仅注重空间结构设计，忽略了骨发育过程中的时间复杂性，无法有效响应甚至阻碍骨愈合，导致骨再生质量不佳。同时，羟基磷灰石（HAp）在骨再生中虽至关重要，但其结构和空间分布的调控一直是难题，不同结晶度和形态的 HAp 对骨愈合影响各异 。
为解决这些痛点，来自四川大学的樊渝江、孙勇教授团队开展了相关研究。他们结合 3D 打印技术与超临界 CO₂ foaming 技术，通过有机 - 无机整合和表面成核生长的方式，将结构化的 HAp 集成到分级组装支架中。利用可控沉积和分级组装技术，调控微纳结构化 HAp 的空间分布和释放时间，使其与骨愈合过程相匹配。相关工作以 “Spatially programmed hydroxyapatite in hierarchically assembled scaffold self - adapts osteogenic progression” 为题发表在《Chemical Engineering Journal》上，为骨修复材料的设计提供了新方向，有望实现高质量的骨再生。
研究内容
1. 装饰有空间编程羟基磷灰石的分级组装支架自适应成骨进程
通过构建分级组装支架并调控其中球形 HAp（sHAp）和纳米花状 HAp（fHAp）空间分布与释放时间的研究方法，研究了支架对免疫微环境的改善作用、为骨基质成熟提供钙 / 磷来源的能力以及与整个骨再生周期的匹配情况。结果表明，调控 sHAp/fHAp 的空间分布和释放时间，能有效改善免疫微环境，提供满足骨基质成熟所需的钙 / 磷，使支架自适应骨再生的各个阶段，实现从促进早期免疫调节到为骨组织生长持续提供营养物质的功能，最终达成与骨再生周期的良好匹配，促进高质量骨再生。
图 1. 装饰有空间编程羟基磷灰石的分级组装支架自适应成骨进程示意图
2. 纳米花状 fHAp 的制备与表征
通过在 PLGA 或 HC 薄膜表面利用模拟体液（SBF）溶液进行可控沉积的方法制备纳米花状 fHAp，运用扫描电子显微镜（SEM）、透射电子显微镜（TEM）观察其微观形貌，使用 X 射线衍射（XRD）分析相组成和结晶度，采用接触角测量仪测定表面亲水性，利用 TG/DSC 测试样品的相转变温度和无机成分含量，借助 X 射线光电子能谱（XPS）检测 HC 水凝胶中螯合的钙离子，用钙比色测定试剂盒量化钙离子释放。研究了 fHAp 的微观结构、结晶度、亲水性、钙离子释放等特性。结果表明，fHAp 呈花状，有 50 - 300nm 的多孔结构，结晶度为 31.24%（相对于 sHAp），亲水性较好，且能更快释放钙离子。
图 2. 纳米花状 fHAp 的制备与表征。
3.纳米花状 fHAp 调节巨噬细胞 M2 极化
将炎症刺激的巨噬细胞与负载 fHAp 和 sHAp 的薄膜共培养，运用 SEM 观察细胞形态，通过细胞骨架染色辅助分析，利用流式细胞术检测巨噬细胞表型，采用 ELISA 试剂盒测定炎症相关蛋白和因子的表达。研究 fHAp 对巨噬细胞极化行为的影响。结果显示，fHAp 组巨噬细胞呈典型 M2 形态，M2 巨噬细胞数量显著增加，M1 巨噬细胞数量减少，同时抗炎因子 TGF-β1 和 IL-10 表达升高，促炎因子 TNF-α 和 IL-1β 表达降低，证明 fHAp 可促进巨噬细胞向 M2 极化。
图 3. 纳米花状 fHAp 调节巨噬细胞 M2 极化。
4. 纳米花状 fHAp 的生物学功能
通过水接触角测试、激光共聚焦显微镜观察、Transwell 实验、细胞增殖实验、透射电镜观察和免疫荧光染色等方法，研究 fHAp 在蛋白质吸附、干细胞迁移与招募、细胞增殖与铺展以及胶原矿化方面的能力。结果表明，负载 fHAp 的薄膜接触角更小，蛋白质吸附更均匀且强度更高，能更好地促进干细胞迁移和招募，对细胞增殖和铺展的促进作用也更明显，同时可有效促进胶原纤维矿化，使矿化后的胶原纤维在 TEM 下对比度更高，免疫荧光染色也证实了这一点。
图 4. 纳米花状 fHAp 的生物学功能。
5. 分级组装支架的构建及免疫调节作用
以 3DP PLGA/sHAp 支架为基础，负载纤维凝胶螯合的 sHAp 并在表面整合 fHAp 构建分级组装支架，运用 COMSOL Multiphysics 软件进行离子扩散模拟，使用 SEM 和激光共聚焦显微镜观察 HAp 分布，通过细胞与支架共培养实验、免疫荧光染色和流式细胞术检测细胞行为和巨噬细胞极化情况，采用 ELISA 测定炎症因子表达。研究支架的构建、HAp 的空间分布与释放行为以及免疫调节功能。结果显示，支架中不同位置的 HAp 扩散速率不同，且 MHCP 支架能促进细胞黏附、增殖和铺展，诱导巨噬细胞向 M2 极化，降低促炎因子表达，增加抗炎因子表达，具有良好的免疫调节能力。
图 5. 分级组装支架的构建及免疫调节作用。
6.成骨分化和胶原矿化
将骨髓间充质干细胞（BMSCs）接种在分级组装支架上培养，采用碱性磷酸酶（ALP）和茜素红（ARS）染色观察细胞成骨分化和矿化结节形成情况，通过实时定量逆转录 PCR（qRT-PCR）分析成骨和血管生成相关基因的表达，利用 Micro-CT 分析裸鼠皮下异位成骨情况，结合组织学染色和免疫组化染色观察新骨形成和胶原纤维矿化。研究分级组装支架对 BMSCs 成骨分化和胶原矿化的影响。结果表明，MHCP 组的 ALP 和 ARS 染色更明显，相关基因表达上调，裸鼠皮下新骨形成更多，胶原纤维矿化更显著，证明该支架能有效促进成骨分化和胶原矿化。
图 6. 成骨分化和胶原矿化。
7.分级组装支架修复临界尺寸颅骨缺损
构建兔颅骨缺损模型并植入不同支架，通过推出试验评估支架与周围骨组织的整合能力，利用 Micro-CT 和 X 射线成像系统分析新骨形成情况，采用 RNA 测序研究分子机制，结合免疫荧光染色观察相关蛋白表达。研究分级组装支架修复颅骨缺损的效果及机制。结果显示，MHCP 支架的推出力更高，新骨体积分数更大，能更好地促进骨再生，其通过调节免疫反应、促进细胞黏附和阳离子运输等机制实现高效骨修复。
图 7. 分级组装支架修复临界尺寸颅骨缺损。
8.分级组装支架自适应骨再生过程
对植入分级组装支架的兔颅骨缺损在不同时间点取材，通过组织学染色（H&E、Masson、ARS）和免疫荧光染色（CD44、Runx2、CD31、OPN 等）观察骨再生各阶段的细胞行为、组织变化和分子调控。研究分级组装支架在骨再生不同阶段的作用。结果表明，在骨再生早期，fHAp 促进巨噬细胞极化和干细胞招募；中期，支架引导组织长入和早期成骨、血管生成；后期，支架完成使命，骨基质重塑为致密新骨组织，实现了高质量的骨再生。
图 8. 分级组装支架自适应骨再生过程。
研究结论
本研究结合3D打印技术与超临界CO₂发泡技术，通过有机-无机整合和表面成核生长的方式，构建了具有全再生周期调节能力的时空分级组装支架。该支架将纳米花状fHAp作为骨愈合早期微环境的调节开关，结合支架中结构化HAp的时空释放，增强了骨重塑过程，最终实现了临界尺寸骨缺损的再生。这一成果为可降解骨修复材料的结构和功能设计提供了新的研究思路，有望推动骨修复领域的发展，为临床治疗骨缺损相关疾病提供更有效的解决方案。
文章来源：https://doi.org/10.1016/j.cej.2025.162437
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