Nature | 通过自愈水凝胶中球体融合实现高细胞密度3D生物打印

来源：江苏激光联盟

据悉，需要细胞模型来研究人体发育和体外疾病，并筛选药物的毒性和功效。当前的方法在功能组织模型的工程设计中受到限制，这些模型具有必要的细胞密度和异质性以适当地建模细胞和组织行为。来自美国宾夕法尼亚大学生物工程学院的研究人员开发了一种生物印刷方法，可将球状体以高分辨率转移到自愈水凝胶中，从而使其图案化并融合到规定空间组织的高细胞密度微组织中。该研究成果2021年2月2日发表在Nature上。

生物制造技术，例如生物印刷，可以将细胞编程组装成复杂的3D几何形状。但是，这些技术主要用于处理嵌入水凝胶中的细胞，这限制了细胞与细胞之间的相互作用并导致低细胞密度的构建体远低于生长功能组织所需的构建体。这激励了专门为球体量身定制的生物制造技术的发展，通常称为生物组装，该技术利用球体的能力通过液体状聚结来融合，以最大程度地减少界面处的无粘合剂能量。

在该研究中，来自宾夕法尼亚大学的研究人员开发了一种方法，其中球状体可以通过剪切变稀的水凝胶进行平移，水凝胶可以自我修复以在3D空间中接收和保持球状体，包括球状体之间的定向融合以形成具有确定形状的高细胞密度微组织，从水凝胶中去除。支撑水凝胶的自修复性能可实现球体的精确定位（高达球体直径的10％）和印刷后的球体高生存力（〜95％），而自修复水凝胶具有粘弹性和非粘性有助于在培养过程中控制相邻球体之间融合为稳定结构。

▲图解：a. 示意图（上），明视野图像（中）和荧光图像（下）说明：(i) 培养基储库中的MSC球状抽吸，(ii)球状转移到自愈支持水凝胶（FITC标记）中，以及（iii）通过从微量移液器吸头中除去真空，将球状沉淀沉积在载体水凝胶中。图像代表n=4个独立实验。b. 客体-宿主载体水凝胶的流变学特性表明：(i) 剪切稀化特性–粘度随着剪切速率（0-100 s-1）的不断增加而降低，以及(ii)自修复特性-储存通过低（0.5％应变，10 Hz）和高（阴影，100％应变，10 Hz）应变循环恢复损耗模量。c. 客体（金刚烷，蓝色）和主体（β-环糊精，橙色）修饰的支撑水凝胶（含FITC微粒）的透明质酸之间的可逆相互作用使得（i–ii）在球体平移过程中剪切作用下支撑水凝胶的局部屈服，以及（iii）球状平移后支持水凝胶的快速愈合。(iv) 支撑水凝胶（球体标为虚线圆）的位移图，显示了在球体平移过程中水凝胶在球体前后的局部运动。图像代表n=3个独立实验。所有比例尺250 μm。

▲自修复水凝胶中的3D生物打印球体

为了证明这种生物打印方法的实用性，研究人员通过生物打印包含空间控制密度的诱导多能干细胞（iPSC）衍生的心肌细胞和原代人心脏成纤维细胞的微组织，开发了一种模仿心肌梗塞后疤痕的心脏病模型。生物打印的模型复制了心肌梗死后出现的心脏病变（收缩输出减少和电同步性降低），他们使用该模型来探查可改善心脏再生和心肌细胞增殖功能的miRNA治疗剂。

▲图解：(i) 通过将iPSC衍生的心肌细胞（iPSC-CM）与原代成年心脏成纤维细胞（CFs）按确定的细胞数比例混合（健康的比例为4：1；疤痕的比例为1：4）来发展健康且受到疤痕的球体。上图：细胞接种后3天拍摄的图像（心肌肌钙蛋白T（cTnT）（红色；iPSC-CMs；波形蛋白(绿色；CFs)）。比例尺50μm。下图：在健康和疤痕过长的球体中，第3天对α-肌动蛋白（绿色；肉瘤）和cTnT（红色；iPSC-CM）进行了免疫荧光染色。比例尺10微米。

▲图解：(i) 健康和瘢痕心脏微组织环的3D生物打印示意图，以及(ii)在支持水凝胶中融合5天后，健康和瘢痕心脏微组织中cTnT和波形蛋白的免疫荧光染色。比例尺100微米（插入50微米）。

研究人员建立了3D生物打印的心脏纤维化模型后，接下来希望利用该系统研究用于心脏修复的microRNA（miRNA）治疗剂。在心肌梗死后的缺血环境中细胞死亡后，成年人的心脏组织自我修复能力有限，尤其是由于CM的非增殖性质。


生物打印技术的进步使得能够开发出能够更好地模仿天然组织和器官的复杂性的体外模型和可植入结构。其中许多技术依赖于都依赖于处理嵌入水凝胶中的细胞悬浮液，这使得用天然组织样细胞密度和异质性以及由此产生的功能来工程化组织变得具有挑战性。在这里，研究人员开发的能够对高细胞密度组织模型进行3D生物打印的方法，并且可以精确控制微组织结构和局部异质性。这可以通过应用自愈水凝胶来实现，该凝胶支持3D空间中生物打印的球体的生物组装和融合，以形成连续的细胞密集的组织模型。他们通过对心脏微组织疾病模型进行生物打印来证明该方法的潜力，该模型概括了MI后出现的病理性瘢痕形成特征，并使用心脏功能的读数（收缩、电生理同步），能够探查修复的miRNA治疗方法。该方法具有很高的通用性，可以与各种各样的球体和类器官系统一起实施，这为精确模型的3D生物打印提供了许多机会来模拟疾病和进行药物筛选。

本文来源：Andrew C. Daly et al. 3D bioprinting of high cell-density heterogeneous tissue models through spheroid fusion within self-healing hydrogels, Nature Communications (2021). DOI: 10.1038/s41467-021-21029-2