【解析】骨组织3D打印技术打印，成为骨再生的未来希望

据报道美国异体骨移植患者的人类免疫缺陷病毒感染率为１／ １６０万 。近些年来人造材料，如羟基磷灰石、硫酸钙等已用于骨缺损的填充，然而实际效果逊于自体或异体骨，为此，人们正在探索新的途径和技术来破解骨缺损治疗的临床难题。３Ｄ打印技术的兴起或许可以为解决上述难题带来希望。

３Ｄ生物打印是组织工程学的一种高速仿形技术，以计算机三维设计模型为蓝本，利用激光引导、喷墨打 印等技术，将生物材料通过逐层堆积粘结，叠加塑型，最终形成仿真的组织或器官。１９９９年，Ｗｉｎｄｅｒ等 利用ＣＴ扫描并三维重建出颅骨缺损的外形，并应用３Ｄ打印技术快速打印出合适形状、大小钛金属植入体，用 于治疗患者颅骨缺损并获得成功。Ｉｇａｗａ等则利用３Ｄ打印技术成功打印出磷酸三钙植入骨，修复了狗颅骨缺损部位。骨组织３Ｄ打印需要合适的聚合材料，在组织打印过程中能够保护细胞功能完整，同时保证打印后组织内细胞营养运输及废物的排出。如何构建３Ｄ骨模型、自然成骨、促进骨愈合、提高细胞成活率以及减少免疫原性，成为骨组织３Ｄ打印亟需解决和突破的重要研究课题。综合现有研究工作和进展，我们归纳出理想的３Ｄ骨组织打印的雏形：

（１）以骨骼缺损为原型，以生物可吸收高分子化合物为材料，快速打印出具有骨硬度、多孔、利于细胞生长的结构支架；
（２）细胞可黏附于支架并能增殖、分化成骨，支架的多孔结构有利于氧气及营养的供给，有利于骨组织生长及血管新生，并可避免应力屏蔽效应；
（３）生物支架可提供细胞生长分化所需的细胞因子，如血管内皮生长因子促进血管新生、骨形态发生蛋白促进细胞增殖分化，为细胞成骨提供持续的微环境。这一技术可能是骨再生最有效的方法，甚至可能实现完美的骨重建和关节重塑。

1.３Ｄ打印骨组织的生物支架
生物支架是３Ｄ骨组织打印的基本框架，需具备易打印性、与缺损部分的契合性、良好的生物相容性、骨诱导性、力学稳定性、可塑性、生物降解性等特性，目前主要有金属、生物陶瓷、聚合材料、聚合材料与生物陶瓷或金属与生物陶瓷的复合材料作为备选。

1.1金属支架
钛合金质轻、强度高且具有优良的生物相容性，是理想的植入人体的植入物。将前成骨细胞种植钛合金支架上培养，可检测到纤维连接蛋白、黏着斑蛋白、细胞数量、碱性磷酸酶、细胞外基质钙化结节均增加，显示 多孔结构的钛合金支架可促进前成骨细胞黏附、增殖、分化、矿化 。我们将多孔的３Ｄ打印钛合金移植物植入羊的Ｃ３－Ｃ５椎体，通过微计算机断层扫描技术（ｍｉｃｒｏｃｏｍｐｕｔｅｄｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ，Ｍｉｒｏ－ＣＴ）扫描重建及组织染 色均可观察到大量骨组织长入移植物内。虽然３Ｄ打印金属支架生物相容性好、抗压能力强，但金属支架打印需要在高温条件下进行，支架打印时不能同步涂层生物活性分子或细胞混合打印。

1.2生物陶瓷支架
生物陶瓷具有抗压能力强、生物相容性好、骨诱导能力强等优点，被广泛用于组织工程研究。目前主要有磷酸钙、磷酸二正硅酸钙、双相磷酸钙、硅酸钙／β－磷酸三钙等材质的陶瓷支架， 其抗压强度可达到松质骨生物力学要求。３Ｄ打印的陶瓷支架可促进细胞成骨性分化和血管新生。羟基磷灰石支架可促进牙神经鞘干细胞成骨性分化，双相磷酸钙支架中β－磷酸三钙的含量增加可促进细胞成骨性 分化，硅酸钙／β－磷酸三钙支架中硅元素释放可促进成骨样细胞合成ＢＭＰ－２、ＴＧＦ－β发挥成骨作用。 ＮＡＧＥＬ支架促进人脐静脉内皮细胞增殖及血管形成。虽然陶瓷支架生物相容性好、骨诱导能力强、抗压性能好，但是陶瓷支架同样需要高温下进行打印，打印时不能 对支架同步涂层促进骨形成的生物活性分子或抗感染的药物 ，同时其脆性高、韧性差、剪切应力弱。

1.3聚合材料支架
聚合材料具有促进细胞成骨性分化、细胞黏附、可控降解等优点，亦被广泛用于组织工程研究，如聚乙二醇、聚乳酸、聚己内酯等。聚己内酯支架与骨髓干细胞共打印，体外研究发现细胞表达碱性磷酸酶、骨钙素、Ⅰ型胶原增加，将含有人重组骨形成蛋白的聚己 内酯支架植入兔子尺骨中段骨折部位，观察到骨量明显增加，同时支架降解缓慢。增加支架的粗糙程度可提高细胞的黏附能力，将聚乙二醇分子上修饰ＲＧＤ及ＰＨＳＲＮ，３Ｄ打印出含有成骨细胞的生物支架体外培养，黏着斑染色观察到成骨细胞黏附数目增加。聚合材料支架在增加新骨生成、促进细胞黏附方面有很大优势，但是与细胞混合打印的高分子支架抗压能力较弱，不能达到人体骨的抗压要求。同时聚合材料降解产生酸性产物，降低局部ｐＨ值，会引起炎症反应；局部环境ｐＨ值降低可加速聚合材料酯键水解，促进聚合材料降解，影响支架生物力学作用。

1.4复合材料支架
为更大程度上满足３Ｄ骨打印支架的需求，聚合材料与陶瓷或者金属与陶瓷混合制成的复合材料支架成为新的突破。结合陶瓷支架与聚合材料支架的优点，如同骨组织中胶原与钙盐的有机结合，更接近真实的 骨基质环境，被许多学者用于３Ｄ骨组织打印研究。聚合材料与陶瓷制成的复合材料抗压能力增强，接近松质骨力学性能。β－硅酸钙／聚乙丙交酯复合支架 体外及在体研究均表现出促进成骨及促进组织血管新生的能力。在复合材料支架中添加生物活性物质，如ＢＭＰ－２、ＶＥＧＦ，可进一步刺激支架内血管、骨量的增加，因此，包被生物活性分子的复合材料将成为３Ｄ骨打印支架的最佳选择。

2.３Ｄ打印骨支架的多孔结构与微环境
在临床中大量骨组织移植后，氧气及营养供给不足是移植后成活率降低的重要原因之一。可供植入细胞利用的氧气在几小时内就被消耗殆尽，而局部血管新生传送氧气和营养需要几周的时间，即植入的大部分细胞在获得足够的氧气和营养之前就可能失去功能或凋亡。３Ｄ打印骨组织的多孔结构可持续提供氧气与营养，同时可消除应力屏蔽作用，且其表面形貌粗糙可促进细胞黏附。

2.1孔径与孔隙率
３Ｄ打印多孔组织其孔径大小、孔隙率及孔径交联度均影响细胞存活、组织长入。Ｋｕｂｏｋｉ等１９９８年报道了移植物的多孔结构可促进骨再生，将喷涂有ＢＭＰ－２的实体和多孔的羟磷灰石分别植入大鼠体内，发现 实体羟磷灰石表面没有骨生成，而多孔的羟磷灰石内部有骨生成。Ｒｏｙ等２００３年发现将附着有２０％β－磷酸三钙的聚丙交脂的多孔移植物，其孔隙率为８０％～８５％，孔径为１２５～１５０μｍ，植入兔子的颅骨部位，发现形成 骨量较多。Ｋａｒａｇｅｏｒｇｉｏｕ等 ２００５年报道孔径交联可增加营养运输、细胞迁移、细胞桥连及组织长入的能力。

2.2 血管新生
３Ｄ打印骨内血管的新生会影响组织植入体内后的功能重建，亦是衡量３Ｄ打印骨组织能否在临床中应用的重要标准。骨内脉管系统可供给距离血管１００μｍ以内的组织的氧气和营养。有学者观察到将嵌有细 胞的工程骨植入体内，距离血管１００～２００μｍ范围内的细胞可获得营养供应。也有学者观察到将孔径为 ５２３μｍ、孔隙率为７０％的聚己内酯／磷酸钙支架植入后，骨缺损部位新生血管明显增加 。还有学者在孔径为２７５μｍ、４００μｍ的３Ｄ打印支架中均观察到大量的新生血管，而支架孔径为１００μｍ时观察到新生血管 相对较少 ，因此不同材料的多孔结构支架中孔径和孔隙率与打印骨组织内血管新生及新生血管长入的深度密切相关。

2.3促进成骨
３Ｄ打印骨组织的成骨性分化是衡量工程骨优劣的主要指标，多孔结构有利于细胞的增殖、分化，促进骨组织长入。明胶共打印羟磷石灰圆柱形多孔支架促进骨原细胞增殖，且在体研究发现交联孔径１００～４００μｍ、孔隙率７５％的支架较适合骨原细胞增殖及成骨性分化。双向磷酸钙支架孔径为３００μｍ时，促进细胞 增殖能力强于磷酸三钙支架。目前学者们均认为多孔支架促进成骨，但孔径、孔隙率、交联度是多少时最适合成骨，并没有统一的标准，这可能与支架材料不同有关。

3.３Ｄ骨以及其他细胞联合打印
３Ｄ细胞打印技术是一种在体外将细胞定植于人造器官的特定位置、构造三维多细胞体系的技术。生物体内细胞和细胞外基质按照一定的空间结构排列形成，细胞在细胞外基质中精确定位是维持生物结构、形态和功能完整性的必要条件。３Ｄ骨组织打印将细胞与支架同时打印，利于在支架原位成骨，实现完美骨再生。目前用于３Ｄ骨组织打印的细胞主要有骨原细胞、胚胎干细胞、成体干细胞（脂肪、骨髓、间质）、诱导多能干细胞及内皮细胞。

3.1骨原细胞与内皮细胞共打印
骨原细胞具有成骨性分化能力，内皮细胞有促进血管新生能力。成骨性细胞与内皮细胞共同打印于３Ｄ组织中，细胞间通过直接接触、缝隙连接、自分泌／旁分泌等途径，完成信息交流，促进血管新生、骨组织形成。将人真皮微血管内皮细胞与人成骨肉瘤细胞ＭＧ－６３细胞定植于３Ｄ打印骨组织中进行体外培养，观察到大量微血管样结构形成，分泌ＶＥＧＦ水平增加，细胞间粘连分子表达上调，同时ＭＧ－６３细胞存活时间明显增加。将ＨＵＶＥＣｓ与人成骨细胞在体外共培养，可检测到ＶＥＧＦ、Ⅰ型胶原、粘连分子表达上调，同时碱性磷酸酶、骨钙素、Ｒｕｎｘ－２等成骨性标记表达明显增加，但骨原细胞数量较少，增殖能力相对较低，不适合大量成骨。

3.2成体干细胞与内皮细胞共打印
成体干细胞具有多向分化潜能，且增殖能力比骨原细胞强，可用于３Ｄ骨细胞打印。骨髓间充质干细胞或脂肪衍生间充质干细胞与ＨＵＶＥＣｓ体外共培养可观察到微血管样结构形成，而ＨＵＶＥＣｓ单独 培养不能形成微血管样结构。有学者研究发现初级成骨细胞与人内皮细胞共培养时，初级成骨细胞通过产生细胞外基质、分泌ＶＥＧＦ等，促进内皮细胞衍生的血管新生。亦有学者发现ＭＳＣｓ与ＨＵＶＥＣｓ体外共培养时，ＨＵＶＥＣｓ抑制ＭＳＣｓ增殖及成脂肪性分化，并且ＨＵＶＥＣｓ通过上调ＭＳＣｓ核内β－链蛋白（β－ｃａｔｅｎｉｎ）及 ｐＳｍａｄ１／５／８表达，激活其内源性Ｗｎｔ及ＢＭＰ信号通路，促进其成骨性分化。尽管干细胞具有多能分化特性，但如何精确调控其定向成骨分化，并配合血管新生，依然是该领域尚未解决的重要科学问题。

3.3胚胎干细胞打印
胚胎干细胞具有在体外培养中无限增殖、自我更新和多向分化的特性，容易诱导成骨，被许多学者用于３Ｄ骨组织打印。将人胚胎干细胞培养形成胚胎，取出间质干细胞，种植在藻酸盐微粒包被的碳酸钙支架上，细胞表达碱性磷酸酶、骨钙素均增加，钙盐沉积明显。若将人胚胎干细胞衍生的间质干细胞，种植在ＲＧＤ修 饰的ＣＰＣ支架中，可显著刺激成骨。胚胎干细虽然有很好的成骨分化特性，但其瘤变率仍无法避免，同时费用也极其昂贵，且存在伦理问题。

3.4ｉＰＳＣｓ细胞打印
ｉＰＳＣｓ细胞是通过基因转染技术将某些转录基因导入体细胞内，使体细胞直接重构成为胚胎干细胞样的多潜能细胞。由于胚胎干细胞在医学应用上存在免疫排斥以及伦理窘境，学者正在尝试用ｉＰＳＣｓ细胞代替胚胎干细胞。将小鼠尾部成纤维细胞重构为ｉＰＳＣｓ细胞，用转化生长因子－β１及转化生长因子－β２处理后，ｉＰＳＣｓ细胞ＲｕｎＸ－２、ＯＳＸ、ＯＰＮ、ＯＣＮ基因表达水平增加，将该细胞种植于羟基磷灰石／碳酸三钙支架，在体研究发现ｉＰＳＣｓ细胞表达骨钙素增加。将ｉＰＳＣｓ细胞种植在用血浆处理后的聚醚砜支架上，其表达碱性磷酸酶、骨钙素显著增加，植入大鼠体内发现骨缺损部位新骨形成量多，愈合快。将人骨髓中ＣＤ３４＋细胞用ｐＥＢ－Ｃ５病毒转染后重构为ｉＰＳＣｓ细胞，培养并种植在磷酸钙支架上，发现ｉＰＳＣｓ细胞存活时间长，ＡＬＰ、 ＲｕｎＸ－２、Ⅰ型胶原等成骨基因表达水平显著增加，骨盐合成增多。将含有ＢＭＰ－２基因的慢病毒转染到ｉＰＳＣｓ－ＭＳＣｓ，种植在碳酸钙支架上，显著促进该细胞成骨性分化及骨盐形成。虽然通过病毒转染添加“重新编程”基因或取代细胞中有缺陷基因的方法可能引起感染，且可能产生细胞瘤变，但是ｉＰＳＣｓ技术不使用胚胎细胞或卵细胞，无伦理学问题，同时制备ｉＰＳＣｓ细胞为患者体细胞，无免疫排斥问题，且可制备的细胞数量充足。

4.３Ｄ打印骨组织与生物降解
３Ｄ打印骨组织植入体内促进骨缺损部位功能重建，在骨骼功能重建过程中细胞产生新的基质代替支架，最终达到骨组织缺损前的生理状态，材料降解最理想的情况是新生基质与材料降解的速度在时间、空间能够同步，且打印组织材料降解不影响骨骼局部生物力学。Ｗａｎｇ等 发现β－ＣＳ／ＰＤＬＧＡ复合材料支架植 入家兔体内，在４、１２、２６周时新骨形成分别是１６．３３％、２８．７％、２６．３７％，支架降解率在４、２０周分别是３３．７１％、６５．７２％，表明β－ＣＳ／ＰＤＬＧＡ支架不但有骨诱导效应、促进骨形成，且该支架降解率更接近新骨形成速度。 Ｗａｎｇ等将骨传导性好的β－磷酸三钙与骨诱导性好的β－ＣＳ制成混合型多孔生物陶瓷支架，植入股骨缺损部位，发现β－磷酸三钙与β－ＣＳ比例为１∶１时，在第４、１２、２６周新骨形成量是１９．５４％、３０．００％、２３．５５％，相应支架降解率分别为１９．４８％、５２．３６％、６６．８１％，即该支架降解与新骨形成接近同步，这样骨组织形成与支架降解在时间、空间上几乎同步进行，能够促进骨组织局部缺损更快愈合。

随着研究的深入，骨组织３Ｄ打印在骨移植方面的潜能受到越来越多学者的关注，现有的研究已经发现骨组织３Ｄ打印在提供营养和氧气、生物力学、细胞成骨性分化、支架降解等方面均有重要作用。骨组织３Ｄ打印在骨科具有十分广泛的应用前景，例如骨肿瘤切除后骨组织植入。北京大学第三医院已完成世界首例用３Ｄ打印技术人工定制枢椎椎体治疗寰枢椎恶性肿瘤的手术，该植入物为用钛合金粉末３Ｄ打印出的枢椎，这标志着３Ｄ打印技术已经在脊柱外科临床中应用。基于上述研究中骨组织３Ｄ打印的优点以及研究人员进一步的努力和探索，骨组织３Ｄ打印将是骨再生的未来。

编辑：南极熊
作者：郑 扬，李危石，刘忠军 （北京大学第三医院骨科）