运用生物3D打印建立高度异质性的胶质母细胞瘤微环境

来源：BioArt生物艺术

胶质母细胞瘤是致死性最高的恶性肿瘤之一，严重威胁人类的健康。胶质母细胞瘤具有高度异质性，其肿瘤微环境是一个包含肿瘤细胞，巨噬细胞，以及多种体细胞的高异质性动态系统。胶质瘤细胞与微环境中的其他细胞产生复杂的相互作用，其中巨噬细胞和小胶质细胞占肿瘤组织的30%-50%，对肿瘤的发生，发展和转移有重要影响。

现有的体外模型在重建微环境的异质性和材料的仿真性上有其局限性，而体内模型虽然形成复杂的微环境，但建立人源肿瘤异种移植模型（PDX）需要使用免疫缺陷动物，也限制了对肿瘤细胞与巨噬细胞的重要相互作用进行深入研究。体外人源类器官模型在一定程度上解决了异质性的问题，但其重复性和量化性仍有待改善。

使用与肿瘤微环境中细胞外基质（ECM）匹配的生物材料，来建立包含多种细胞的高通量、高重复性的体外模型，将有助于研究和发现潜在的癌症驱动基因和他们发挥作用的机制，从而为建立有效的靶向治疗提供方向。

2020年6月4日，加州大学圣地亚哥分校Jeremy Rich教授，Shaochen Chen教授，西湖大学谢琦研究员作为共同通讯作者（UCSD纳米工程系博士研究生汤忞为排名第一的第一作者）合作在Cell Research杂志上发表了题为Three-dimensional bioprinted glioblastoma microenvironments for modeling cellular dependencies and immune interactions的研究论文。

他们运用数字光处理3D生物打印技术和透明质酸（HA）衍生材料，将胶质母细胞瘤干细胞（GSC），巨噬细胞、星形胶质细胞和神经前体细胞（NPC）按照健康组织包围肿瘤组织的结构分布，建立了3D胶质母细胞瘤微环境体外模型。

依靠生物打印建立的3D体外模型有高重复性、高通量、可控性，可用于研究肿瘤微环境中免疫反应及巨噬细胞对肿瘤生发转移的影响；3D模型中的GSC的转录谱可用于预测患者的生存和对药物的敏感性；此模型还可作为全基因组CRISPR-Cas9筛选平台，用于发现特定于3D多细胞微环境中的依赖性和潜在癌症驱动基因。


该研究中设计了两种3D模型，NPC和星形胶质细胞打印在外围模拟健康脑组织；tri-culture模型中，肿瘤部分由GSC或单核细胞（巨噬细胞前体）构成；tetra-culture模型的肿瘤部分包括了GSC和巨噬细胞（或单核细胞）（图1）。

图1：生物3D打印GBM模型流程及模型的明场、荧光图。

通过比较悬浮培养，含GSC和不含GSC的3D模型中的单核细胞的基因表达和转录谱，显示含有GSC的3D肿瘤微环境促进单核细胞向M2表型极化，M2表型能够促进肿瘤发展（图2）。

图2：（左）GSC在悬浮培养和3D模型中的转录谱有显著差异。（右）未诱导分化的单核细胞在3D微环境中极化成促进肿瘤的M2表型，M2相关标记CD163和IL10表达显著增加，M1相关标记TNF-a和NOS2没有显著变化。

通过比较悬浮培养，含巨噬细胞，和不含巨噬细胞的3D模型中GSC的药物反应和肿瘤浸润程度，发现GSC在3D培养中耐药性更强，巨噬细胞增强GSC耐药性，并且促进了GSC转移（图3）。

图3：（左）GSC在悬浮培养，3D tri-culture，3D tetra-culture中对EGFR抑制剂及temozolomide药物的反应。（右）GSC（绿）和巨噬细胞（红）在tri-culture和tetra-culture中的荧光示意图，巨噬细胞增强了GSC转移。

作者进一步使用全基因组CRISPR-Cas9基因敲除文库筛选出3D 肿瘤微环境中依赖性显著的基因，并通过体外GSC成球培养实验和小鼠体内成瘤验证了这些靶点的可靠性。

总结一下，该研究报道了一个可控、可重复、可量化的3D打印胶质母细胞瘤微环境模型，它更精确的模拟了肿瘤微环境中的细胞高异质性、细胞相互作用、脑和肿瘤微环境的ECM成分，可用于研究巨噬细胞对肿瘤的影响，显示了巨噬细胞前体在3D肿瘤微环境中能够自发向促进肿瘤的表型极化。提供了一个在体外高通量研究肿瘤微环境的平台，可用于发现针对肿瘤的潜在靶点。

幕后花絮谢琦：该项学科交叉合作源起于一作们之间的一次干细胞培养基借用，再往上溯源，得益于SD(圣地亚哥) 500人学术交流群，前后几任群主悉心维护，经常组织线下学术交流报告，思想碰撞，促成了无数合作，取得了众多成果。笔者在SD只有短短2年，却通过这样的学术交流活动认识了很多志同道合的朋友，从他们身上学习良多，拓宽了自己将来的研究方向。回国后之所以入职西湖大学，很重要的一个原因也是因为这里特别鼓励和支持各种形式的交流和合作，让我能够始终保持在SD那些年形成的开放和合作心态。我也时常鼓励自己的学生，要和学校的其他实验室开展交流，不妨从互借东西开始，说不定你的下个合作者此时正在向你借培养基的路上。

参考文献
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2. Polyak, K., I. Haviv, and I.G. Campbell, Co-evolution of tumor cells and their microenvironment.Trends Genet, 2009. 25(1): p. 30-8.
3. Rossi, G., A. Manfrin, and M.P. Lutolf, Progress and potential in organoid research.Nat Rev Genet, 2018. 19(11): p. 671-687.