浙大杨华勇院士团队 | 多工艺多材料同步新型生物3D打印方法

来源：生物设计与制造


本文来自本刊主编浙江大学机械工程学院杨华勇院士团队，介绍了一种可实现多工艺多材料同步构建的新型生物3D打印方法，该方法可以支持多种生物材料的同步沉积打印。本研究提出的多材料生物制造方法非常灵活，可适用于基于天然生物材料、合成生物材料、细胞聚集体或复合材料的生物墨水，并能准确复现异质组织的复杂组成。模块化的喷头设计增加了组合打印方法的灵活性，可以将挤出式、喷墨式、光固化式、静电纺丝等多种打印技术融合到打印过程中，也可根据制造精度或所选生物材料的要求进行个性化定制。利用上述功能完备的混合生物3D打印系统，可以实现在同一打印平台上构建无法用单一工艺打印的复杂异质组织或器官。

生物3D打印：有效构建仿生组织和器官的技术
生物3D打印是生物制造领域的一项重要技术，旨在创建功能性仿生结构。灵活自由、丰富多样且功能全面的生物3D打印技术通过将细胞、生物材料或生长因子组装成生物墨水来制造复杂的生物结构[1,2]。传统的生物3D打印技术现在面临着诸多挑战，包括打印水凝胶结构整体机械稳定性与构建体的生物微环境仿生程度和打印组织/器官的血管化等问题。科研人员已经普遍意识到，仅用单一材料构建功能齐全的组织/器官是不现实的。天然组织器官的复杂生物材料组成和细胞多样性，使得单一材料生物3D打印技术无法满足其体外构建的需求[3]。

多材料生物3D打印
为解决当前遇到的困难，多材料生物3D打印是一种简单明了的方法，能够构建含多种材料与细胞的异质结构，可以更好地模拟天然组织/器官。对于目前最常见的生物3D打印方法，包括挤出、喷墨和光辅助打印，国际上各研究组已经进行了一些多材料打印的尝试，业内著名学者美国Terasaki生物创新研究所的Ali Khademhosseini等人对此已经进行过总结和讨论[4,5]。目前的多材料挤出打印和喷墨打印具有简单直接和材料切换速度相当快的优点，但它们限于生物墨水本身的流变学性质，对生物材料的选择有所局限。光辅助技术分辨率高，但多种材料切换需要复杂的机制，花费相对较长的时间，并且适用的生物墨水需要在可能具有细胞毒性的光引发剂的辅助下才能交联。在异质结构中整合具有不同性质的生物墨水仍然是生物3D打印功能化的组织/器官目前遇到的重要挑战，亟需更先进的制造技术提供支撑。

多工艺融合打印
采用单一工艺进行生物制造很难突破各种生物墨水材料带来的限制。为了充分发挥不同生物材料的特性，将多种打印工艺结合到一个装备平台上是有意义的。而且复杂异质组织器官具有宏-微-纳复合拓扑结构，难以用一种打印手段对各级精细结构进行完美呈现，因此我们需要将多种生物3D打印手段结合起来进行制造，譬如集成挤出式打印的多重墨水适配性与喷墨式打印的精准性可以对细胞和生物材料的空间分布进行更好的调控。现阶段我们仅能找到很少的案例进行过此类尝试，包括数字光处理（DLP）和挤出、挤出与静电纺丝的组合[6,7]，而这对于体外制造活性组织是远远不够的。

为何我们要尝试多材料同步构建异质结构？
大多数多材料打印技术遇到的问题在于其很难在有限的时间（为保持生物材料活性）内对复杂异质组织进行有效构建。由于CAD建模、路径规划或装备复杂度等各种挑战，即使装备了多个打印喷头，现阶段的打印设备也仅能做到同时打印多个重复结构，或进行序列式打印。我们认为，在采用增材制造方法，层层堆叠进行打印时，在同一层内的不同细胞等活性生物因子应同步进行打印。这不仅可以极大地缩短打印时间，提高组织活性，还能促进不同种材料之间的融合，提高所构建组织的整体机械性能。

模块化设计的同步打印平台
为了提高构建多层结构的打印效率，国内外的研究人员开发了一种两个喷头独立控制的多轴笛卡尔系生物3D打印机和使用多个可以并行打印的六自由度（6-DOF）机器人构建的生物3D打印装备[8,9]。虽然这些方法能够使用两个喷头同时进行生物3D打印，但它们缺乏使用更多打印方法同时进行生物3D打印的能力。

为了解决当前存在的难题，本研究设计了一种基于多个喷头独立控制的生物3D打印方法，该方法可以支持多个喷头的同时打印。模块化设计增加了组合打印方法的灵活性，可以根据制造精度或所选生物材料的要求进行定制（如图1所示）。本文提出的多材料生物制造方法非常灵活，适用于基于天然生物材料、合成生物材料、细胞聚集体或复合材料的生物墨水，并能准确再现异质组织的复杂组成。由于采用模块化设计方法，同轴打印和嵌入式生物3D打印技术也可以轻松应用从而实现更复杂的人体组织/器官的构建。此外，还可以通过模块化设计引入其他基于喷嘴的打印方式，如基于液滴的挤出、静电纺丝等技术，以实现工艺融合的复合制造。

图1 适用多材料(a)和多工艺(b)的生物3D打印混合制造系统示意图

打印展示
利用上述功能强大的复合生物3D打印平台，可以构建一些单一方法无法打印的复杂异质组织/器官。作为演示，使用所提出的基于多喷头的多材料打印方法打印全层血管化皮肤补片模型和三层管状类血管模型。如图2a所示，设计的皮肤补片模型可以通过传统挤出、同轴挤出、喷墨和基于光辅助的打印技术结合来制造。图2ai-2aiv表示皮肤补片模型的真皮层、皮下血管、微血管层和表皮层的构建。可以发现，构建全层血管化皮肤补片模型所需的生物材料因层而异，而本文的多材料生物3D打印技术能够在合理的短时间内准确复现实际皮肤组织模型。

为了更好地验证本研究提出的方法在多层管状生物组织构建中的优势，设计了一个直径约800 µm的三层空心管模型（如图2c所示）。三种不同的生物墨水分别用于构建内层、中间层和外层。如图2d所示，基于多喷头挤出的多材料生物3D打印技术构建的三层管状模型贴合紧密，在共聚焦显微镜下，内外血管贴合良好，形态保持良好（图2e）。

此外，本文对管状模型进行了细胞培养，可以观察到，在构建的模型中培养四天后，平滑肌细胞MOVAS保持高度活性（图2f）。共聚焦显微镜显示MOVAS可以均匀分布在管状模型的表面。在高倍镜下，这些细胞彼此紧密连接，形成肌肉细胞层（图2g），这表明本研究的同步多材料生物3D打印方法拥有创建具有高细胞活性的多层复杂结构的能力。

图2 多材料异质生物组织的构建: (a) 基于多喷嘴技术构建的多层血管化皮肤补片模型的打印过程；(b) 打印生成的皮肤补片模型；(c) 三层管状模型及其生物材料分布示意图；(d) 显微镜下观察的三层管状模型（di），三层管状模型的荧光粒子分布（dii）；(e) 共焦显微镜下观察荧光粒子在管状模型内外层的分布；(f) 第四天平滑肌细胞MOVAS活/死染色；(g) 含平滑肌细胞MOVAS的局部血管模型三维共聚焦图像（gi），高倍镜下观察到的MOVAS细胞（gii）

未来展望
随着新打印技术的发展，多材料生物3D打印技术正在不断发展中。在现有生物3D打印方法的基础上，通过重新设计、多功能设备结合组装从而形成拥有新的功能的复合打印技术。该技术还可以随着打印技术的发展，根据需要更换打印单元。目前，人体组织构建的制造技术已经有两种组合，一种是基于挤出和喷墨技术的复合制造方法用于皮肤打印，另一种是基于光固化和挤出的复合制造技术，用于构建含细胞的水凝胶结构。可以预见，在未来的多材料生物3D打印领域，微挤压、喷墨、立体光刻和基于微流控的生物3D打印等多种工艺的复合制造将是主要趋势之一。

除了过程中的复合制造，多材料生物3D打印技术还可以通过使用更先进的材料来得到进一步发展，利用自组装材料实现含细胞精细微结构或生物特异性组织。研究表明，使用自愈性悬浮液可以更自由地在液体中构建复杂结构。此外，多材料生物3D打印可以通过牺牲墨水材料、实现多层管状血管的构建，以及引入刺激响应材料作为生物墨水来实现4D打印在生物制造中的集成，从而改进当前的单一材料设计。

我们相信，通过这种复杂的同步多材料多工艺生物3D打印，最终可以以相对较高的打印效率，打印出含有不同组分细胞和精细微观结构的全功能异质组织/器官，从而实现用于组织/器官移植的目标。