大连理工大学：载有间充质干细胞衍生外泌体的3D打印支架以改善血管生成和成骨

来源：EngineeringForLife  

颅面骨再生是血管生成和成骨的耦合过程，与感染相关，在创伤或肿瘤切除后的骨缺损中仍然是一个挑战。具有多功能治疗特性的3D组织工程支架可以为受感染骨缺损的血管生成和成骨提供许多优势。近日，来自大连理工大学的宋克东研究员、大连理工大学附属肿瘤医院的姜大庆医师联合中科院过程所聂毅研究员团队利用挤压3D打印设计了一种富含微通道网络的混合支架，该支架由脱细胞细胞外基质(dECM)、明胶(Gel)、季铵化壳聚糖(QCS)和纳米羟基磷灰石(nHAp)(dGQH)组成（图1）。

相关研究成果以“3D bioprinting of dECM/Gel/QCS/nHAp hybrid scaffolds laden with mesenchymal stem cell-derived exosomes to improve angiogenesis and osteogenesis”为题于2023年2月9日发表在《Biofabrication》上。

图1 dECM/Gel/QCS/nHAp@Exo混合支架的制造和机制示意图

1. 生物墨水的合成和流变学特性
作者首先测试了dGQ 和 dGQH 生物墨水的流变行为以评估它们的可印刷性。如图2A-B所示，dGQ 和 dGQH 生物墨水的复合粘度和储能模量随温度降低而增加，结果表明所制备的生物墨水具有良好的温度敏感性。此外，由于nHAp含量的增加，凝胶的相对浓度降低，导致dGQH生物墨水的预凝胶温度与dGQ生物墨水相比有所降低（图2E）。生物墨水的粘度随着剪切速率的增加而降低，这是非牛顿流体和剪切稀化的典型行为，特别适用于基于挤出的 3D 打印系统（图2F）。从流变学结果可以看出，生物墨水具有良好的印刷适性和稳定的物理性能，图2I显示了正在打印的支架以及冻干前后的生物打印支架。

图2 dGQ 和 dGQH 生物墨水的流变学特性

2. 支架的理化性质
之后，作者首先对这些支架进行了拉伸和压缩试验，以分析它们的机械性能。由于支架的拉伸和压缩应力-应变分别如图3C-F所示，支架的拉伸模量和压缩模量高于dGQ支架。测试结果表明，nHAp可以在一定范围内提高支架的机械强度，但如果nHAp含量过高，支架会变脆。作者还测试了支架的空隙率（图3G）、蛋白吸附性（图3H）以及支架的温度稳定性（图3I）。

图3 支架的理化性质

3. 支架的亲水性、降解性和血液相容性
接着，作者探究了支架的亲水性、降解性和血液相容性。图4A-B记录了这些支架表面水接触角在20 s内的变化过程。可以直观地发现支架的接触角随着nHAp的增加而增加，表明nHAp可能会降低支架的亲水性。当支架达到溶胀平衡时，dGQH支架的吸水率低于dGQ支架，随着nHAp含量的增加，吸水率略有下降（图4C-E）。

从图4F的结果可以看出，dGQ支架在2周内降解了约80%，到3周时几乎完全降解，不利于新骨组织的形成。而nHAp的加入有效地降低了支架的降解速率，这可能是由于 nHAp 增加了酶反应的空间位阻效应。

此外，溶血是评价生物材料生物相容性的重要指标。在这里，支架的体外血液相容性通过溶血测定进行评估（图4G）。支架的溶血率随着nHAp的添加而降低。dGQH支架的所有溶血率均小于1%，远低于dGQ支架（图4H)。

图4 支架的亲水性和血液相容性

4. 支架的抗菌性能
用于颅骨伤口修复的支架的抗菌活性对于防止感染和加速缺损骨的再生是必要的，因此作者对支架的抗菌能力进行了评估（图5）。支架培养24小时的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的 CFU，表明 dGQ 和 dGQH 支架具有显着的抗菌活性（图6A-B）。随着nHAp含量的增加，其抑菌活性减弱，这可能是QCS相对浓度降低所致。在dGQH支架中，dGQH20具有优异的抗菌性能，在骨组织工程中具有重要的应用前景。

图5 支架的抗菌性能

5. 支架的生物相容性和成骨特性
之后作者在含有不同量的 nHAP（0、20%、30% 和 40%）的支架上培养的hBMSCs 中评估细胞粘附、增殖和成骨蛋白表达（图6）。结果得出 nHAP 掺入模式和嵌入 nHAP 的浓度改变细胞活力和增殖的结论。与不存在 nHAP 的情况相比，nHAP 导致细胞增殖显着减少；随着支架中 nHAP 数量的增加，细胞增殖减少（图6A-B）。

支架的成骨特性通过特定成骨分化标记蛋白（包括 ALP、Runx2 和 Ocn）的表达进行评估。dGQH20支架显示出显着上调的 ALP、Runx2 和 Ocn 表达（图6C）。这些发现表明dGQH20在所有成骨阶段都有效地促进了hBMSC成骨分化，与蛋白质印迹数据一致。为了确定 hBMSCs 在这些支架上的矿物质沉积，在第 14 天进行了 ARS 染色和 V on Kossa 染色（图6D）。

图6 支架的生物相容性和成骨特性

6. hADSCs-Exos 的体外生物学特性及其支架特性
为了评估dGQH20、Exo和dGQH20@Exo支架的生物相容性，CCK-8测定表明Exo 组中的 hBMSC 增殖明显高于对照组（图7A）。与所有其他组相比，在具有独特纳米结构的3D生物打印支架中培养并进一步增强了dGQH20@Exo组中 hBMSC 的增殖。在不同组中探讨了对血管生成和成骨蛋白标记物表达的影响。在指定时间点收集人 BMSC 并进行蛋白质印迹（图7B）。与没有Exos的各自支架组相比，固定在dGQH20 支架上的Exos中 Runx2、Ocn和VEGF的蛋白质表达显着更高。

为了进一步评估促血管生成和促成骨作用，ARS、ALP和V on Kossa染色用于观察hBMSCs的成骨分化，并测量了 HUVEC 在伤口愈合、迁移和管形成中的功能（图7C-D）。与 ALP 染色的趋势相似，ARS 和 V on Kossa 染色表明，与其他三组相比，dGQH20@Exo 组显着增加了hBMSC的矿化结节形成；dGQH20@Exo组HUVECs的伤口愈合和迁移能力明显强于其他组。

图7 hADSCs-Exos 的体外生物学特性

7. 体内骨再生和血管化评估
在证明了dGQH20@Exo支架的体外生物学效应后，之后确定了dGQH20@Exo支架对体内成骨和血管生成的功效。通过植入大鼠颅骨缺损模型 10 周，研究了支架的体内骨再生能力，并在小鼠皮下植入模型中评估了支架的体内血管形成。

为了观察缺损区域的骨再生，将样品切成切片并用 H&E、Masson 的 T richome (MT)、ALP、Runx2、Ocn、CD31 和 VEGF 抗体染色（图8A–C）。结果表明支架组ALP、Runx2和Ocn、CD31和VEGF表达水平较高；特别是对于 dGQH20@Exo组，成骨和血管生成蛋白表达水平被确定为最高。

图8 体内骨再生和血管化评估

综上，本文制备了基于dECM的生物墨水，并通过挤出3D生物打印技术制造了dECM/Gel/QCS/nHAp 3D支架(dGQH)。对支架的形态、机械性能、孔隙率、亲水性、生物降解性、抗菌能力、血液相容性和生物相容性进行了表征和评估。此外，dGQH20混合支架具有良好的抗菌活性以及出色的血液相容性和生物相容性。受天然骨微结构特征和血管化骨再生需求的启发，基于静电相互作用将血管生成因子和成骨因子（Exos）共同负载到dGQH20支架中。结果表明，添加的 Exos 促进了细胞在支架上的附着和增殖，并且在体外和体内 dGQH@Exo 支架中的成骨和血管再生也显着增加。

文章来源：
https://doi.org/10.1088/1758-5090/acb6b8