实现3D胶原蛋白器官支架的高分辨率打印

来源： EngineeringForLife

基于微凝胶的支撑浴中的3D打印能够使用柔软和水状的生物材料构建复杂的结构，但低打印分辨率通常是其在组织工程中实际应用的障碍。近日，来自大阪大学的Michiya Matsusaki团队通过使用含有柠檬酸三钠（TSC）的工程盖兰胶（GG）微凝胶浴实现3D胶原蛋白器官支架的高分辨率打印。将TSC引入浴液系统不仅减轻了GG微凝胶的聚集，导致更均匀的浴形态，而且由于TSC的脱水作用，还抑制了胶原墨水在浴中的扩散，这两者都有助于提高打印分辨率。这项工作为开发用于高分辨率打印胶原蛋白的微凝胶浴提供了一种易于操作的策略，为体外3D器官构建提供了另一种途径。相关论文“3D printing of collagen scaffold with enhanced resolution in a citrate-modulated Gellan gum microgel bath”于2023年5月5日在线发表于杂志《Advanced Healthcare Materials》上。

在微凝胶浴中进行3D打印，可以用柔软且含水的生物材料打印复杂的结构。如图1（a）所示，GG微凝胶浴支持注射印刷，通过喷嘴在浴中的程序化移动，连续挤出胶原油墨以制造设计图案。印刷过程中，微凝胶为墨水提供了机械支撑和固定，避免了印刷结构在重力作用下的变形，如图1（b）所示。GG微凝胶浴是通过将本体凝胶机械研磨成微凝胶片来制备的。如图1（c）所示，通过该方法获得的GG微凝胶通常具有大的粒径和多分散性，因为小的微凝胶由于氢键或离子相互作用而聚集，这不可避免地导致在该浴中印刷精度低。此外，流体胶原油墨在微凝胶之间的大间隙和空隙中的扩散将导致印刷细丝的直径更大和形态更不规则。为了克服这个问题，本工作开发了一种易于操作但有效的策略，基于Hofmeister效应调节GG微凝胶浴，如图1（d）所示。通过简单地将合适的盐引入浴中，可以同时实现小而均匀的微凝胶和抑制的墨水扩散，从而在新的GG微凝胶浴中可以实现提高的打印分辨率。

图1 微凝胶打印过程和打印产品的方案

然后，研究者通过简单的工艺制备了新版GG微凝胶浴（图2（a））。GG本体凝胶之前是通过在100 °C下将GG粉末溶解在PBS中，然后在室温下通过与钠离子形成螺旋结构进行凝胶化来制备的（图2（b））。在浴中添加TSC导致均匀的微凝胶形态，颗粒尺寸显著减小（图2（c-e））。如图2（f）所示，由于其脱水行为，TSC的引入可能会降低GG分子在凝胶中的溶解度，并导致GG微凝胶的相分离，最终降低微凝胶之间表面的相互作用位点。因此，TSC的加入促进了微凝胶的分散。

图2 GG-TSC微凝胶浴的制备工艺和表征

为了揭示TSC对墨水凝胶化速度的影响，如图3（a-b）所示，胶原溶液在凝胶化之前是透明的，但一旦凝胶化就会变成白色和不透明的，因此墨水的颜色变化可以用作监测注入浴中后凝胶化过程的信号。通过测量墨丝的相对灰度值来量化墨水颜色随时间的变化。图3（c）显示了不同浴中墨水的归一化灰度值变化的比较，这表明TSC的添加导致胶原墨水的凝胶化速度更快。较快的凝胶化可归因于TSC对蛋白质（即胶原油墨）的盐析效应。完全凝胶化所需的时间如图3（d）所示。

图3 在浴中印刷胶原的凝胶化表征

为了证明TSC对打印分辨率的影响，在添加和不添加TSC的浴中打印胶原丝，并通过比较在一系列喷嘴移动速度下打印的丝的平均直径来评估分辨率。如图4（a和b）所示，在含有TSC的浴中打印的所有胶原线都显示出具有不同边界的完整形状。为了确定印刷的最佳TSC浓度，在具有不同TSC浓度的浴中印刷网状结构（图4（c））。如图4（d）所示，尽管所有浴都可以打印出完整的网状结构，但打印细节在两个细丝交叉区域的细丝直径和位移方面有所不同。图4（e）显示了网状结构中细丝平均直径的比较。结果表明，随着TSC浓度的增加，细丝直径减小。

图4 胶原油墨在有或没有TSC的浴中印刷的相关表征

如图5（a）所示，通过使用开发的GG-TSC微凝胶浴，可以成功印刷复杂的器官结构。由于GG微凝胶和胶原油墨之间的化学差异，印刷样品可以通过浸入乙醇/水（体积为1:1）中的0.5v/v%GA溶液中，在浴中直接交联。图5（b-l）显示了在开发的GG-TSC浴系统中打印的人耳模型、手、全尺寸人类心脏瓣膜等结构（图5），证明了微凝胶浴的良好打印性。如图5（l）所示，两种色素在节段区域没有任何融合的情况下被分配，这表明胶原模型内部具有良好的结构完整性。高打印分辨率使得通过3D打印技术复制功能器官成为可能。

图5 3D模型和相应的打印胶原蛋白产品

由于TSC是一种常见的水溶性食用食品添加剂，它可以很容易地通过水洗去除。经洗涤和灭菌后，获得的胶原样品可用于与细胞共培养，用于组织工程。如图6（a）所示，将HiPS CM细胞与胶原片共培养，活/死细胞染色显示，细胞以非常高的活力（超过95%）紧密地分布在胶原片的表面上，这表明印刷产品具有良好的细胞兼容性（图6（b））。在胶原上培养HiPS CM细胞7天后，胶原片表现出强烈的跳动行为（图6（c））。图6（d）显示了频率为48 bpm的心脏跳动的代表图。HiPS-CM细胞的协同收缩表明单个细胞彼此之间具有良好的通信。如图6（e）所示，H&e染色表明，HiPS-CM均匀地分布在胶原片的表面上，并紧密地相互附着，在片上形成细胞层。细胞层的协同搏动有助于整体收缩力，并使整个胶原片能够普遍运动。

图6 生物毒性测试

综上，本文开发了一种基于Hofmeister效应的易于操作的策略，以调节GG微凝胶，用于胶原器官支架的高分辨率3D打印。在浴中引入TSC不仅防止了GG微凝胶的聚集，导致微凝胶在浴中的平均粒径减小和良好的分散状态，而且通过盐析效应加速凝胶化来抑制墨水扩散，这两者都有助于提高GG浴中的打印分辨率。通过使用新一代GG微凝胶浴，可以高保真地打印包括手、耳朵甚至心脏结构在内的复杂生物结构。此外，TSC可以很容易地通过洗涤去除，因此印刷产品表现出良好的生物相容性。这项工作提供了一种简单的策略来调节GG微凝胶以高分辨率打印胶原蛋白，为组织工程和医学应用的体外器官构建提供了一条替代途径。



文章来源：

https://doi.org/10.1002/adhm.202301090