清华大学熊卓团队：3D打印具有高细胞密度和异质微环境的血管化肝组织

来源：EngineeringForLife

3D挤出生物打印由于其精确沉积细胞和生物相容性材料（即生物墨水）的强大能力，已广泛应用于组织工程和再生医学。理想的生物墨水应具有良好的可打印性，以产生组织形状的结构，同时屏蔽封装细胞在生物打印过程中免受有害暴露。然而，目前仍然缺乏具有高细胞密度和可打印性的生物墨水极大地限制了打印功能组织的能力。

针对此问题，来自清华大学的熊卓课题组开发了一种基于密集细胞聚集体的颗粒细胞聚集体双相（GCAB）生物墨水来解决这一限制。GCAB生物墨水表现出挤出生物打印所需的剪切稀化和剪切恢复特性以及打印后的超弹性行为，用于模拟软生物组织的机械特性（图1）。通过在定义的异质微环境中预组织GCAB生物墨水，打印出具有增强血管化和代谢功能的致密肝组织结构（图1）。这种通用GCAB生物墨水的设计为创建用于治疗应用的功能组织开辟了新途径。

相关论文以“3D printing of vascularized hepatic tissues with a high cell density and heterogeneous microenvironment”为题于2023年7月20日发表在《Biofabrication》上。

图1 GCAB生物墨水示意图

1. 具有生理密度的通用生物墨水
为了在生物3D打印中用作生物链接，需要大量产生大小和形状一致的细胞聚集体。在这项研究中，作者使用HepG2球体作为样本，因为HepG2是一种癌细胞系，已被广泛用作研究肝功能的模型细胞。为此，使用由10000个微孔组成的PDMS微孔板以高通量产生球状体（图2a-b）。HepG2球体在24小时内自组装，这是因为细胞间相互作用明显高于细胞-基质相互作用（图2c-e）。活/死分析证实大多数HepG2球状体仍然为存活状态（图2f）。

然后，作者通过在GelMA水凝胶内密集堆积GFP-HepG2球体来制备GCAB生物墨水。GFP-HepG2球体用于可视化它们在打印丝内的密集分布（图2i）。作者还成功打印了清华大学的标志“THU”（图2j），通过将打印的结构分解成单个细胞，将细胞密度量化为~1.7×108个细胞，同时在第7天观察到细胞迁移和球体融合（即多个球体的直接聚集）。SEM图像证实了GCAB生物墨水的蜂窝状结构，其中球体紧密堆积并被周围的水凝胶基质分隔开（图2k）。同样，作者生成了直径为115±10 μm、圆度为0.87±0.04的人类间充质干细胞(MSC)球体（图2l）。

图2 开发颗粒状聚集体作为具有生理密度的通用生物墨水

2. GCAB生物墨水的3D打印和机械表征
生物墨水的流变特性对于挤出生物打印至关重要。为了评估聚集体形态对流变特性的影响，作者将GCAB生物墨水与传统的无细胞(CF)和DCL GelMA水凝胶生物墨水的流变特性进行了比较。所有生物墨水都显示出必要的剪切稀化（图3a）、屈服应力（图3b）和自我修复（图3c）特性，并具有快速愈合动态打印后，从而保护细胞免受高剪力墙应力，同时保持结构稳定性。GCAB生物墨水由于其堵塞性质而变得不太对温度敏感（图3d），这表明挤出生物打印的温度窗口延长。随后，作者优化了打印参数，成功打印了高保真双环（图3e）和晶格结构（图3f），表达GFP的球体用于确认GCAB生物墨水的颗粒形态和相邻层之间的互连性。GCAB生物墨水表现出与传统DCL生物墨水相当的印刷适性（图3g）。

图3 GCAB生物墨水的3D打印和机械表征

挤出和自由基聚合过程中的剪切力对细胞活力产生负面影响。存活的球体在培养过程中继续生长（图3k）。GCAB生物墨水表现出比DCL生物墨水更快的增殖速率（图3l）。此外，使用GCAB墨水打印的结构可以承受约50%的应变并弹性恢复数百次，从而验证了其出色的循环压缩性能（图3o）。

3. 异质微环境增强血管化和肝功能
基于以上结果，作者使用GCAB生物墨水创建高细胞密度的器官特异性组织。通过结合悬浮浴将GCAB生物墨水打印到人体解剖结构中。作者成功打印了肝脏模型（图4b）、螺旋图案（图4c）和包含悬垂物和空腔的开放室（图4d）。打印结构和3D模型的配准证实了高形状保真度。接着，作者通过将HUVEC纳入GCAB生物墨水的水凝胶相来重现肝脏致密且异质的细胞微环境。GCAB生物墨水组中的GFPHUVEC主要局限于球状体间区域（图4e-f），而DCL生物墨水组中的HUVEC与RFPHepG2细胞均匀混合（图4g-h）。

在水凝胶的血管形态发生过程中，封装的HUVEC通过整合素与基质相互作用，形成空隙空间（即液泡），这些空隙空间在细胞内和细胞间结合形成管腔。一些较大的液泡已经合并，在细胞内形成大型的管腔结构。毛细管状结构可以维持至少7天（图4i-j）。VEcadherin免疫染色进一步证实了这一点，这对于内皮细胞接触完整性至关重要（图4m-n）。这些发现表明，GCAB生物墨水为体外细胞介导的含腔毛细血管网络的形成提供了更宽松的环境。

图4 异质微环境增强血管化和肝功能

4. 具有可灌注血管网络的功能性肝组织的3D打印
在这项研究中，作者尝试同时制造具有高细胞密度和可灌注血管网络的3D厚组织结构。由于GCAB生物墨水太弱，无法支持包含空隙或通道的打印结构，因此打印了短效墨水作为模板来生成血管网络，同时支持GCAB生物墨水的打印（图5a）。为了提高HUVEC的接种效率和均匀性，使用了原位内皮化策略，将内皮细胞封装在牺牲明胶生物墨水内。荧光显微镜所示，有许多内皮细胞附着在通道表面。SEM图像证实了GFP-HUVEC在第1天的均匀分布（图5e），表明原位内皮化方法具有较高的接种效率。第3天（图5f-g），细胞增殖形成汇合的内皮层。此外，还在第7天观察到可灌注血管网络侵入由GCAB生物墨水组成的周围组织（图5h-i)）。由此可见，通过将GCAB生物墨水与先进的生物打印策略相结合，可以制造具有接近生理细胞密度、脉管系统和功能的个性化器官特异性组织，用于治疗目的。

图5 具有可灌注血管网络的功能性肝组织的3D打印

综上，本文引入了基于颗粒细胞聚集体的双相（GCAB）生物墨水的概念，作为扩展挤出生物打印生物墨水库的通用策略。这种方法提供了优良的生物打印能力，具有高细胞密度、良好的活力和超弹性行为，还打印了具有异质细胞微环境的血管化肝组织结构，由于更紧密的细胞间相互作用而加速了血管化和组织重塑。此外，通过与牺牲打印策略相结合，生产了具有可灌注血管网络的功能性致密肝组织结构，以满足其代谢需求。先进的生物打印策略与GCAB生物墨水的自组织特性的融合，将为创建用于治疗应用的功能性组织和器官开辟新途径。

文章来源：
https://iopscience.iop.org/article/10.1088/1758-5090/ace5e0