基于快速应力松弛生物墨水的工程化3D打印骨骼肌仿生支架

来源： Regenovo

严重创伤、肿瘤切除或肌肉消耗性疾病可能引起体内大面积骨骼肌损失(VML)，该疾病会降低自愈能力，并导致肌肉功能丧失。目前，由于供体部位的局限性和功能缺陷，VML的临床治疗受到限制。组织工程技术被认为是VML修复的潜在治疗选择。由于天然骨骼肌具有高度定向结构，通过生物3D打印各向异性仿生支架等手段来模拟天然骨骼肌的排列结构，并在3D环境中诱导细胞伸长，对于体内肌肉损失修复至关重要。一般来说，具有明显应力松弛的粘弹性水凝胶可以增强细胞的迁移和增殖。然而，目前用作3D生物打印的光固化生物墨水材料多为弹性水凝胶。因此开发具有快速应力松弛的光固化水凝胶生物墨水将有利于体外工程化3D骨骼肌搭建和VML修复。近期，南方医科大学黄文华、吴耀彬教授团队在Acta Biomaterialia期刊上发表了一篇题为Bioprinted anisotropic scaffolds with fast stress relaxation bioink for engineering 3D skeletal muscle and repairing volumetric muscle loss的文章。该研究以明胶甲基丙烯酰（GelMA）和纤维蛋白原（Fibrinogen）为原料，经光交联和酶交联后成功制备得到了一种可调节应力松弛的互穿网络（IPN）水凝胶（FG IPN），通过凝胶内支撑打印（gel-in-gel）的方式，构建了基于生物3D打印的各向异性骨骼肌三维仿生支架，并将其用于VML修复（图1）。该研究将为骨骼肌损伤临床治疗提供新思路。

图1基于应力松弛FG-IPN水凝胶的3D生物打印仿生支架设计和制造示意图

具有快速应力松弛性能的FG IPN水凝胶的制备和表征
通过调节纤维蛋白原和GelMA的浓度比（F:G），FG IPN水凝胶显示出可调的粘弹性（图2a）。研究者通过将浓度比（浓度单位/wt%）分别设定为0:5、2.5:5、5:5，制备得到不同 FG-IPN水凝胶：GelMA、F2.5G5、F5G5（图2b）。由图2c可知，当纤维蛋白原浓度增加时，由于凝血酶和氯化钙交联产生蛋白质纳米纤维，使得纤维蛋白网络数量增加，导致FG-INP水凝胶的透明度降低。同时可观察到GelMA水凝胶在其微孔表面没有任何纳米纤维产生。根据SEM图像进一步分析了FG IPN水凝胶体系的孔隙率和网格密度，发现三组孔隙率无显著差异（图2d）。纤维蛋白原经酶交联后形成具有弱粘弹性的纤维蛋白水凝胶，纤维蛋白凝胶表现出快速的应力松弛，由此加速了FG IPN 水凝胶的应力松弛，说明FG IPN水凝胶的应力松弛性能与连接到网络的纤维蛋白纤维有关(图2f,g)。与F2.5G5和GelMA相比，F5G5水凝胶的储能模量略有增加但没有显著差异(图2h)，这也表明GelMA与纤维蛋白网络之间的相互作用对FG-IPN水凝胶的力学性能有协同作用。

图2 不同混合比例的FG IPN水凝胶应力松弛性能表征示意图

FG IPN水凝胶内的细胞扩散、增殖和分化表征
为了探索FG IPN凝胶中的粘弹性纤维蛋白对细胞的影响，研究者以GelMA（不含纤维蛋白）作为对照组，进一步对含不同纤维蛋白浓度的F2.5G5和F5G5 IPN水凝胶进行了研究。活死染色图像及细胞活性统计结果显示（图3a-b），C2C12成肌细胞存活数量随着培养时间的增加表现出显著的增长。在培养5天后，约有90%的细胞存活，且细胞活力没有显著差异。培养7天后，通过F-actin染色进一步研究粘弹性水凝胶对细胞形态的影响（图3c），与GelMA水凝胶组相比，F2.5G5和F5G5水凝胶组的大多数细胞形态表现出显著的伸长。F5G5组细胞骨架面积明显高于GelMA组和F2.5G5组（图3d-e）。这些结果表明，应力松弛速率在调节三维粘弹性水凝胶中的细胞扩展和延伸中起着关键作用。为了进一步研究水凝胶应力松弛对成肌细胞分化的影响，在分化培养基中培养7天后进行肌球蛋白重链（MHC）染色。免疫荧光染色图像（图3f）显示，F5G5水凝胶内C2C12细胞中肌管形成率和肌管长度显著高于其他组（F2.5G5和GelMA），而且在更快的应力松弛下的水凝胶中可以形成更多的肌管。这些结果表明，细胞通过整合素在纤维蛋白纳米纤维上施加力，并且纤维蛋白的重新排列增强了细胞粘附的能力并使得它们可以沿着蛋白纳米纤维铺展（图3i）。

图3 FG IPN水凝胶中C2C12细胞的形态和分化表征结果

FG IPN水凝胶在Carbopol负载凝胶中的打印性能表征
以FG IPN水凝胶为生物墨水，通过凝胶内支撑打印策略制造生物3D打印的仿生支架，并对FG IPN凝胶的物理性能进行研究，以确认打印工艺的可行性（图4a）。FG溶液在低于15 °C下转化为物理交联的凝胶（图4b-c）。预冷FG凝胶的粘度随着剪切速率的增加而显著降低（图4d）。这种剪切稀化特性使得FG IPN生物墨水容易挤压通过打印针头。为了制备最佳的Carbopol负载凝胶，探索了三种浓度（0.2wt%，0.8wt%和1.4wt%）的Carbopol负载凝胶性能。通过透明度（图4e）、流变性能（图4f）以及维持打印结构性能的表征结果，最后选用0.8wt%的Carbopol负载凝胶以保持打印支架稳定性与良好的观察透明度。

为了分析打印参数对Carbopol负载凝胶中的水凝胶纤维的线宽的影响（图4g-h），对水凝胶施加不同的移动速度（3、5、7、9和11 mm/s）和打印压力（1.0、1.5、2.0、2.5和3.0bar）。结果表明，打印纤维的线宽随着打印压力的增加而增加（图4i），而在Carbopol负载凝胶中随着移动速度的增加而减小。为了确认Carbopol负载凝胶的打印可行性，在15 °C下使用应力松弛FG IPN水凝胶在Carbopol支撑的凝胶中打印3D结构“SMU”，看到打印的结构保持良好而没有任何塌陷（图4j）。如图4 k-l所示，研究者通过3D打印制备了仿生定向排列骨骼肌支架（支架尺寸：15 × 6 × 4mm（长×宽×高）），并在光交联和酶交联后，成功从Carbopol负载凝胶中取出3D支架（图4m）。

图4 FG IPN水凝胶在Carbopol负载凝胶中的3D打印性能表征

基于FG IPN水凝胶的生物3D打印定向排列骨骼肌体外模型
研究者利用上述所用方法在Carbopol凝胶介质中对载有C2C12成肌细胞的FG生物墨水进行打印（图5a），经光交联和酶交联后，将形成的载有细胞的支架从Carbopol凝胶中顺利移除用作后续研究。其中以未经过3D打印直接形成的负载细胞的3D凝胶组作为对照组。活/死染色图像及细胞存活率结果显示(图5b-c)，生物3D打印定向排列支架组中细胞存活率约90%（与3D凝胶组内细胞存活率一样高）。此外，在与第1天和第3天未填充纤维的细胞相比（图5d），培养5天后的C2C12成肌细胞在定向排列仿生支架内显示出更好的生长和伸长的形态。立体显微镜荧光图像（图5e）展示了培养7天后，3D支架内的完整细胞分布。细胞骨架的面积覆盖率在3D支架组和3D凝胶组之间没有显著差异（图5f）。共聚焦图像和细胞取向的极性分布显示C2C12成肌细胞在3D支架中具有伸长的细胞骨架，而这在3D凝胶组中不明显（图5h-i）。许多肌管在3D支架中形成并伸长，表明其具有诱导肌管融合形成的能力（图5j）。

图5 生物3D打印定向排列骨骼肌体外模型性能表征

基于FG IPN水凝胶的3D生物打印支架的体内炎症和微血管化研究
为了研究基于FG-IPN水凝胶的无细胞3D生物打印支架用于体内VML修复的潜力，研究者在SD大鼠背部皮下植入支架，两周后评估其炎症和体内微血管形成能力。H&E染色图像显示，3D定向排列支架组比3D凝胶组表现出更低的炎症水平（图6a-c/e-g）。组织外观图像显示（图6a、e），在植入14天后，3D支架组中的植入区域中出现微血管。而3D凝胶组未显示显著的微血管形成。H&E染色表明(图6d、h)在3D支架组中形成了血液微血管壁。相比之下，3D凝胶组在第14天后血管数量较少。此外，3D支架组中的毛细血管数量显著高于3D凝胶组中的毛细血管数量(图6j)。与3D凝胶组相比，3D定向排列支架组中毛细血管的覆盖率显著增强(图6k)，这表明应力松弛FG IPN水凝胶的纳米纤维结构和定向排列纤维之间的距离对于体内血管化有一定作用。

图6 3D生物打印骨骼肌支架植入大鼠背部14天后体内细胞炎症和血管生成研究

3D生物打印FG-IPN水凝胶支架诱导VML修复
在大鼠胫骨前肌中构建VML缺损，然后将无细胞支架植入VML缺损中。H&E染色图像显示(图7a-b)，在手术两周后，3D支架组比其他组形成了更多的新肌纤维。图7d结果发现空白组和3D凝胶组纤维区周围密度明显增强，其中空白组中纤维化区域周围的密度增强程度最显著（蓝色代表胶原，红色代表肌纤维）。3D支架组中新形成的肌纤维的数量显著高于空白组和3D凝胶组，这表明3D支架诱导肌纤维形成的能力较强(图7a，f)。此外，3D支架组中形成的微血管比空白组和3D凝胶组中形成的微血管更多。同时定量分析也显示（图7g），3D支架组中的毛细血管数量高于空白组和3D凝胶组中的毛细血管数量。

图7 植入三维排列支架2周后的大鼠模型修复瘢痕肌损伤表征

在术后6个月，进一步研究VML修复后的大鼠功能恢复情况。使用超声成像观察并定量分析骨骼肌损伤的修复区域(图8a)，发现不同组的横截面积和侧截面积没有显著差异，表明在损伤区域中肌纤维发生了填充（图8b-c）。另外，采用跑台运动试验检测大鼠的运动能力，观察修复后6个月骨骼肌的功能行为，结果表明3D支架组大鼠比空白组和3D凝胶组大鼠的跑动距离更大，即该组小鼠具备更好的运动能力(图8d-e)。通过电刺激测量肌生理反应，在平行方向上应用3D支架的骨骼肌损伤中的肌纤维显著高于空白组和3D凝胶组中的肌纤维(图8 g)。

图8 植入FG IPN水凝胶基三维生物打印仿生支架6个月后的大鼠骨骼肌损伤模型功能肌再生测试

总结
该研究通过纤维蛋白原和GelMA的组合开发了一种应力松弛性能可调的FG IPN 水凝胶。将FG IPN水凝胶作为生物墨水材料，通过凝胶内支撑打印策略打印各向异性仿生支架，分别应用于体外三维骨骼肌组织模型和体内VML修复。研究结果表明具有更快应力松弛的FG IPN水凝胶显示出更好的细胞增殖和的分化特性，并能促进微血管和肌肉生成，有利于VML修复后骨骼肌再生。因此，构建基于FG IPN水凝胶的3D生物打印定向排列支架不仅有助于构建准确的生理学3D体外模型，而且对于体内骨骼肌再生具有多种应用价值。