微生物的可控和生物相容性生物3D打印技术：基础、环境应用和挑战

来源： GK绿钥生物科技

天津大学环境科学与工程学院赵迎新副教授团队在《Biotechnology Advances》期刊发表综述“Controllable and biocompatible 3D bioprinting technology for microorganisms: Fundamental, environmental applications and challenges”文章简要介绍了微生物3D打印的原理和环境应用，系统总结了微生物3D打印的潜在方法和可行性，描述了结合3D打印性和微生物亲和力的生物墨水的优化选择，分析了微生物3D打印在环境领域的应用与发展。

生物3D打印是一种新的3D制造技术，可用于精确分布和负载微生物，形成具有多种复杂功能的微生物活性材料。本文系统分析了生物3D打印的基本技术原理、生物墨水材料及其在环境领域的应用，并提出了生物3D打印在环境领域的挑战和未来展望。结合目前微生物增强技术在环境领域的发展，生物3D打印将发展成为多功能微生物的使能平台，并促进对原位定向反应的更大控制。

由于细菌对环境具有很强的适应性以及多样化的代谢活动，可以在各种恶劣的环境中茁壮成长。各种细菌在特定环境中可以形成稳定的菌落结构。然而，微生物在环境生存中也面临着许多挑战。例如，悬浮微生物的损失、各种不利因素的影响、环境温度的变化等，都会导致生物处理效率下降甚至系统崩溃。在极端情况下，如何保护和回收微生物已成为微生物领域中一个重要的解决难题。水凝胶包埋可以通过使得微生物能维持矿化的优势物种，并使细菌对环境压力源脱敏。最常见的水凝胶包埋技术是微球包埋。微球包埋的特点在于比表面积大、反应效率高等。然而，该技术难以适应水处理中恶劣的条件，无法以可靠或可重复的方式生产定制的材料结构。生物3D打印作为一种增材制造工艺，也被公认为是一种新型制造，生物3D打印技术为解决上述问题提供了新的可能性。基于微球包埋技术以及其他领域的生物3D打印原理，进一步发展为微生物的生物3D打印是可行的。利用新兴的生物3D打印技术嵌入细菌，创造具有可控3D形状、微观结构和动态代谢反应的“活体材料”。
基于生物3D打印的优势，作者从四个方面分析了生物3D打印在微生物3D打印方面的可行性，包括：①微生物3D打印潜在技术及其可行性的系统分析;②优化可打印性和微生物亲和力相结合的生物墨水选择;③微生物3D打印在环境领域的应用;④以及微生物3D打印的挑战。旨在为未来适应环境修复的生物3D打印技术研究提供指导和思路。

首先，作者进行了微生物3D打印的潜在技术及可行性分析。作者列举了三种生物3D打印方式进行说明；

图1 三种3D生物打印技术示意图：（a） 激光式生物打印;（b）喷墨式生物打印;（c）挤出式生物打印

作者对图1三种打印技术分别做了相关分析：基于激光的3D生物打印技术（LBB）是能够做到精确定位打印的，这种打印方式存在很多的优点：它能够以高分辨率（< 10 μm）定位小至几百微升的细胞悬液，从而可以打印高细胞密度的生物材料（高达1×108cells/mL）和具有中等粘度（<300 mPa/s）的水凝胶前体。此外，无喷嘴、非接触式工艺、高活性（95%）和高分辨率细胞打印、墨滴控制和精确输送的特点使该工艺有望应用。同时也存在有一定的缺点，例如LBB所需的感光高分子材料价格昂贵，单次打印的材料利用率不如喷嘴打印高，表明其在控制成本方面竞争力不强。

基于喷墨的3D生物打印（IBB）也是组织工程中经常使用的一种生物打印方法。IBB最重要的优势之一是其相对较高的打印分辨率（30–100 μm），这种打印方法具有较好的可操作性和一定的梯度打印能力。同时，IBB具有极高的打印速度（约1-10,000滴/秒，与普通字符喷墨打印机相似）。但由于微流控原理的局限性，应用于IBB技术的生物墨水需要极低的粘度（3–12 mPa/s）和细胞浓度（106cells/ml），以及打印结构的连续性和强度差的问题，从而阻止了具有特定三维结构的更复杂样品的构建，除上述缺点外，造成这种情况的主要原因是该技术对微生物造成的严重热损伤或机械损伤。

基于挤出的生物3D打印（EBB）因其独特的梯度打印能力和广泛的生物材料相容性而成为最有前途和应用最广泛的生物打印技术。其优势在于通过多通道挤出结构实现的梯度打印能力，利用多通道打印能力，挤出式生物打印还可以同时实现对多细胞成分和多材料成分的精确控制，以构建微生物群体感应的双网络结构，EBB具有良好的材料相容性和生物相容性，高度灵活的打印参数范围，极高浓度的打印单元也是EBB技术的一个明显优势。然而，打印精度受喷嘴（>100 μm）的影响很大，生物墨水在通过喷嘴挤出过程中的受到剪切效应，细胞存活率低于其他方法。


随后作者结合3D打印性和微生物亲和力优化生物墨水的选择进行相关研究。各种类型的生物墨水已被证明在打印组织工程细胞时有利于生物活性。因此，对于生命力旺盛、繁殖能力强的微生物，天然和合成高分子水凝胶等组织工程中常用的生物墨水非常适合微生物的生物打印。作者先后总结了天然水凝胶中的壳聚糖、海藻酸钠、透明质酸、胶原蛋白、明胶、丝蛋白、合成聚合物水凝胶、聚丙烯酸、聚乙烯醇等水凝胶做了优缺点的相关介绍和在3D生物打印中的应用。

图2 双网络的形成机理

作者提出了关于多网络水凝胶的相关研究。单一成分水凝胶的关键问题是，单一结构通常不能同时具有3D打印过程所需的物理化学性质和封装生物体所需的生化性质，这通常是相互排斥的。为了解决这个问题，已经研究了几种具有代表性的方法，例如双网络，大分子微球复合材料，滑环和纳米复合材料，以改善凝胶的机械性能，同时确保良好的生物适应性。在这些材料中，双网络（DN）水凝胶是当前研究的重要热点和趋势。

图3 常见生物墨水的结构（a）壳聚糖;（b）海藻酸钠;（c）透明质酸;（d）胶原蛋白;（e）明胶;（f）聚丙烯酸;（g）聚乙烯醇

图4 基于3D生物打印的自养反硝化与异养反硝化过程的耦合示意图

图5 微生物3D打印在环境领域的应用：（a）清除污染物;（b）微生物电化学;（c）用于制造生物膜材料的模具;（d） 生物催化剂的制备;（e）4D孢子生物打印

图6 微生物3D打印在环境领域的应用研究实物图

图7 生物3D打印的优化方法示意图

作者还做了生物3D打印技术在环境领域的应用与展望。详细地从有效去除难降解有机污染物、微生物电化学、用于制造生物膜材料的模具、生物催化剂制备、生物4D打印等几个方面说明了生物3D打印技术在该领域的应用。同时也列举了以上相关领域应用的相关打印技术和生物墨水，对相关参数也列举了一些表格，详细数据请查阅原文。

最后，作者指出随着微生物技术在环境领域的快速发展和3D打印技术的不断发展，生物3D打印技术已成为一种新兴的、有前途的技术。然而，由于该技术仍处于探索阶段，因此存在一些重要的挑战。例如本综述中提到在生物墨水的优化与创新、促进工程菌的广泛应用、 4D打印的研究与开发等等。

总结：生物3D打印技术通过开发适合不同微生物生存和繁殖的生物墨水基质，使多种微生物在同一打印体中共存。具有任意复杂形状的多材料3D打印技术，加上微生物代谢反应的多样性，使得以可控的方式制造具有前所未有的功能的细菌生物材料成为可能。生物3D打印已成功应用于有机污染物去除、微生物电极、生物膜制造和生物催化剂制备。特定生物墨水的选择和优化，工程细菌应用的进一步发展以及具有时间维度的4D打印技术的开发，使生物3D打印具有广阔的应用前景。

文章来源：https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2023.108243