《Nature Communications》：“生物3D打印＋”策略用于难愈合骨缺损的治疗

来源： EFL生物3D打印与生物制造

难愈合骨缺损（超过临界尺寸的节段骨和骨质疏松骨缺损等）由于内源细胞的迁移受限或再生潜能较弱，无法自行愈合，其修复与功能重建是临床上一个棘手的问题。由生物材料和健康细胞构成的组织工程骨替代物为解决这一问题带来了新的希望。尽管过去二十年骨组织工程取得了巨大进展，但仍未解决体外培养耗时且无法精准调控细胞分布等难题。挤出式生物3D打印技术可以实现细胞的精准投递，为个性化定制材料-细胞复合体提供有效途径。然而，如何平衡挤出打印过程细胞活性和支架力学稳定性方面的难题，既保证3D打印技术的精准度和支架尺寸，同时还能维持负载细胞高存活率，具有较大的挑战性。

为了解决这一难题，来自中国科学院深圳先进技术研究院阮长顺团队受到心脏搏动泵血的启发，提出了一种力学辅助的“生物3D打印＋”新策略，首先结合3D打印构建了具有力学响应的大尺寸复杂结构的中空纤维水凝胶支架，然后利用支架力学响应性能实现细胞快速、均匀、精准及友好地加载。基于该策略所获得的细胞负载支架，有效地促进了难愈合骨缺损的修复与功能重建。该策略有效解决了当前挤出式生物3D打印过程中如何平衡细胞活性和支架力学稳定性方面的难题，为组织工程与再生医学等领域提供新的思路。

相关研究成果以“A mechanical-assisted post-bioprinting strategy for challenging bone defects repair”为题于2024年4月26日发表在《Nature Communications》上。

1. 创新型研究内容   

本研究制备了一种可以对力学刺激做出可逆响应的心脏启发式结构高度可调的中空纤维水凝胶支架（HHS），可实现快速、均匀、精准及友好地负载。采用甲基丙烯酰化明胶、纳米粘土和N-丙烯酰甘氨酰胺的混合墨水，通过一步式同轴打印，在无任何内核支撑材料的情况下，实现高保真度和大尺寸HHS的构建，且HHS具有均匀完整且结构高度可调的中空纤维。HHS表现出出色的弹性、快速的形状恢复和优异的疲劳抗性，在压缩应变达80%下可以快速恢复，并且压缩循环1万次后仍能保持完整的结构。此外，通过压缩应变、循环次数可以实现对其力学响应行为的调控。HHS的力学响应行为使其在力学刺激下实现细胞的快速（4 s）、精准和分区负载。与静态条件下相比，HHS负载细胞数量提高了13倍。本研究进一步验证了负载细胞的HHS对大鼠节段性和骨质疏松骨缺损的修复效果。结果表明，负载细胞的HHS展现出令人满意的治愈效果。总的来说，本研究工作为细胞和生物材料的功能组装提供了一种新的、通用的、高效的途径，推动组织工程及细胞治疗用于再生医学。

【大尺寸复杂结构HHS构建】
本研究基于同轴3D打印，在没有任何内核支撑材料的情况下，一步法直接构建大尺寸复杂形状的组织工程骨（图1a, b）。采用具有优异打印性、足够力学强度及生物相容性的甲基丙烯酰化明胶/硅酸锂纳米粘土/ N -丙烯酰甘氨酰胺复合材料作为打印墨水，经同轴针头的外壳挤出后紫外光照射固化，获得具有高保真度稳定形状的HHS，可以悬浮在水中，中空通道清晰可见（图1c），表明构建具有中空结构的HHS可行性。

图1 “生物3D打印＋”策略及组织工程骨支架构建示意图

【中空结构和网格可调的HHS】

HHS的中结构和网格具有高度可调控性。如图2a所示，研究者定义了HHS中空纤维内径和外径（分别为d和D）、同层两根中空管之间的最近距离（L）、中空纤维的空间体积（V1）以及网格内部的体积（V2）。如图2b,c和d所示，可以清晰地观察到光滑均匀的空心管，空心结构完整以及高保真度的网格，其L、D和D具有广泛的可调性。通过GeSiM Robotics软件可以轻松调节Lx，而通过调节同轴喷嘴的内外尺寸可以调节中空管的Dy（y范围为0.4 ~ 0.8 mm）、dz（z范围为0 ~ 0.6 mm）和壁厚Dy - dz（0 ~ 0.4 mm），从而调控HHS的性能，表明研究团队打印的HHS具有出色的可设计性。

图2 HHS可调的中空结构和网格

【HHS的可压缩性、弹性、形状恢复性和疲劳抗性】

HHS具有优异的压缩性和回弹性，快速的形状恢复以及优异的抗疲劳性能。研究者进一步通过压缩和循环压缩实验，全面研究了中空纤维内径d对HHS力学行为的影响。随着d的增加，HHs的压缩强度和弹性提高，即使在80%的应变后仍然保持完整且可以恢复到初始状态（图3a）。此外，研究者通过萤光液体直观地呈现了HHS的压缩恢复速度，一个周期的压缩和形态恢复仅需要4 s，且1 s内即可快速恢复，与心脏收缩和舒张搏动相似。随后，在应变为40%的情况下，验证了HHS的可重复性和抗疲劳性（图3c,d）。无中空结构的支架在102个循环后发生了严重的损伤，而HHS在104个循环后保持结构完整。结果表明，HHS具有优异的抗疲劳性能。

图3 HHS的力学性能

【HHS的力学响应性】

HHS具有力学响应行为，能够快速响应外界力学的刺激。研究者为了进一步研究其力学响应性，将HHS浸泡在有或无力学刺激的水中，如图4a、b所示，在没有力学刺激的情况下，其吸水能力取决于网格而不是GLN水凝胶的溶胀或HHS的中空结构（图4c）。此外，HHS吸水率随应变和循环次数的增加而显著增加，而不含V1的HHS吸水率则保持恒定（图4d-f）。此外，L和d也会显著影响HHS水吸收。此外，在20%和40%的应变下，吸水率随循环次数的增加而显著增加（图4f）。由此可见，在动态力学刺激下，V1使得HHS具有良好的力学响应能力，且随着d、应变和循环次数的增加，其力学响应能力增强。

图4 HHS的力学响应性

【HHS快速、均匀、精准及友好负载细胞的能力】

本研究基于HHS的快速压缩恢复能力和优异的力学响应性，开发了一种力学辅助的“生物3D打印＋”策略，以实现快速、均匀、精确和友好的细胞负载。如图5a,b所示，与静态条件相比，4 s内HHS负载的细胞数量显著提高了约13倍，这表明V1 -力学响应途径的主动性和有效性。培养3 d后，HHS中细胞分布均匀且增殖明显。同时，HHS中负载细胞的数量随着压缩应变（图5c）或循环次数（图5d）的增加而增加，表明研究者提出的策略具有可控制性。在传统的组织工程中，无法将多种类型的细胞分区引入到支架中。在本研究中，利用V1和V2之间不同的力学响应性，可以实现多个细胞的精确分区负载。如图5ei所示，研究者进一步开发了一种简单的V2-力学响应途径，与直接接种细胞相比，细胞均匀分布在整个HHS的V2中（表面-中间-底部）（图5eii,eiii）且HHS的V2中的数量提高了约200%（图5eiv）。如图5f所示，通过V1+V2-力学响应的连续过程，实现了两种细胞分区负载于在V1和V2中。此外，HHS可维持内皮细胞表型和促进干细胞成骨分化（5g,h）。

图5 HHS力学响应负载细胞

【负载细胞的HHS修复难愈合骨缺损】

本研究进一步评估了负载细胞的HHS修复大鼠临界节段性骨缺损和骨质疏松骨缺损的能力。对于大鼠大尺寸节段性骨缺损的修复（图6），负载细胞的HHS相比于空白和HHS组术后6周显著促进周围新生血管的形成，术后12周在股骨缺损的近端和远端形成桥接，且负载细胞的HHS新生骨量可达到HHS组的2.5倍。在大鼠骨质疏松骨缺损修复方面，术后4周和8周负载细胞的HHS组相比于空白和HHS组同样呈现更为优异的骨再生能力（图7）。研究表明，对于难愈合骨缺损而言，结合细胞的HHS在骨缺损的修复与功能重建方面显示出令人满意的治疗效果。

图6 负载细胞的HHS修复大鼠大尺寸节段骨缺损的研究

图7 负载细胞的HHS修复骨质疏松大鼠骨缺损的研究

2. 总结与展望
总之，本研究通过一种简单的一步同轴打印方法，在无内核支撑材料的情况下，成功3D打印制备了一系列中空纤维结构高度可调的大尺寸复杂结构HHS。所得到的HHS表现出优异的弹性、快速的形状恢复和出色的疲劳抗性，并显示出可控的力学响应行为。利用HHS力学响应性能可实现细胞快速、均匀、精准及友好地加载。所获得的细胞负载HHS，有效地促进了难愈合骨缺损的修复与功能重建，推进了组织工程在骨再生领域的应用。本研究提出的力学辅助“生物3D打印＋”新策略，有效解决了当前挤出式生物3D打印过程中难以平衡细胞活性和支架力学稳定性方面的难题，为细胞和生物材料的功能组装提供了一种新的、通用的、高效的途径，推动组织工程及细胞治疗用于再生医学。

文章来源：https://doi.org/10.1038/s41467-024-48023-8