中国人民解放军总医院：3D 生物打印 M2 巨噬细胞外囊泡模拟物促进血管再生

来源：EFL生物3D打印与生物制造

3D生物打印组织移植物在再生医学中具有广阔前景，但其临床转化面临两大核心挑战：一是植入后引发的异物反应（FBR），导致纤维包膜形成和炎症持续，阻碍移植物与宿主组织整合；二是血管化不足，造成移植物缺氧和功能障碍。研究表明，生物材料的刚度会诱导巨噬细胞向促炎的M1表型极化，加剧FBR，而传统细胞疗法存在存活难、伦理风险及成本高等问题。   

为解决上述难题，中国人民解放军总医院的付小兵院士、杜晓辉主任和黄沙教授开发了一种基于M2巨噬细胞源细胞外囊泡模拟物（M2-EVMs）的创新策略。团队通过膜挤压技术制备了M2-EVMs，将其作为生物墨水添加剂融入3D打印支架中，利用M2-EVMs抑制M1极化、促进M2极化及血管生成的特性，减轻FBR并增强组织再生能力。在皮下植入和皮肤伤口模型中，搭载M2-EVMs的3D打印支架显著减少了纤维包膜厚度，提升了血管密度和伤口愈合效率，展现出良好的生物相容性和再生效果。   

相关工作以“Bioprinted M2 macrophage-derived extracellular vesicle mimics attenuate foreign body reaction and enhance vascularized tissue regeneration”为题发表在《Biofabrication》上。

图 1. 巨噬细胞源细胞外囊泡模拟物（EVMs）作为生物墨水添加剂用于抑制异物反应（FBR）和促进再生。

研究内容
1. 3D生物打印支架刚度对异物反应的影响，通过皮下植入不同刚度的3D生物打印支架，结合H&E染色、免疫荧光及转录组测序，研究支架刚度与异物反应（FBR）及巨噬细胞极化的关系。结果表明，硬支架（Young’s模量0.285 MPa）显著诱导M1巨噬细胞极化（CD86+比例达80%），纤维包膜厚度（164.7±44.2 µm）是软支架的3倍，且促炎基因（如IL-6、TLR4）显著上调，证实刚度通过加剧M1极化恶化FBR。      

图2. 3D生物打印支架刚度与异物反应及巨噬细胞极化的相关性。   

2. M2巨噬细胞源细胞外囊泡模拟物（M2-EVMs）的制备与表征，利用膜挤压技术结合超声破碎和梯度离心，制备了M1/M2-EVMs，并通过HR-TEM、NTA及蛋白质印迹分析其结构和成分。结果显示，M2-EVMs呈圆形囊泡结构（粒径约100 nm），高表达M2标记蛋白（如CD206、Arg1），低表达促炎蛋白（如TLR4），且能被成纤维细胞、内皮细胞和巨噬细胞有效摄取（6 h内摄取率>70%）。      

图3. M2-EVMs的制备流程及形态、成分表征。   

3. M2-EVMs对体外细胞行为的调控作用，通过划痕实验、管形成实验及RT-qPCR，研究了M2-EVMs对成纤维细胞、内皮细胞及巨噬细胞的功能影响。结果表明，M2-EVMs显著抑制成纤维细胞活化（α-SMA表达降低50%）和迁移，促进内皮细胞血管生成（管形成数量增加80%），并诱导巨噬细胞向M2表型极化（CD206+比例从10%升至45%），而M1-EVMs作用相反。      

图5. M2-EVMs对成纤维细胞、内皮细胞及巨噬细胞的体外调控作用。   

4. 生物墨水特性与EVMs释放行为，通过流变学测试、SEM及释放曲线分析，研究了含EVMs的明胶-海藻酸盐水凝胶墨水的打印适性和释放特性。结果表明，EVMs添加未显著改变墨水的剪切变稀特性（黏度≈1000 mPa·s）和机械性能（Shore A硬度18.8-19.1°），且能在72 h内持续释放（累积释放率≈80%），均匀分布于支架孔隙中。      

图6. 含M2-EVMs的生物墨水特性及释放行为分析。

5. 含M2-EVMs的3D生物打印支架的体内性能评估，通过皮下植入和全层皮肤伤口模型，结合H&E染色、Masson染色及免疫荧光，研究了M2-EVMs对FBR和组织再生的影响。结果显示，搭载M2-EVMs的硬支架纤维包膜厚度仅26.7±7.6 µm（较对照组降低58%），血管密度增加3倍，伤口愈合率提升40%，并促进毛囊和血管再生，而M1-EVMs组炎症反应加剧。      

图 7. M1 - 和 M2-EVMs 对皮下植入模型中异物反应及巨噬细胞极化的影响。

图 8. M1 和 M2 巨噬细胞来源的 EVMs 对皮下植入模型中胶原沉积和血管生成的影响。

图 9. M1 - 和 M2-EVMs 对伤口治疗模型中伤口愈合的影响。

研究结论
本研究开发了一种基于M2巨噬细胞源细胞外囊泡模拟物（M2-EVMs）的3D生物打印策略，以解决3D打印组织移植物的异物反应（FBR）和血管化不足问题。通过膜挤压技术制备的M2-EVMs可抑制巨噬细胞向促炎M1表型极化，促进血管生成相关因子分泌，并有效被成纤维细胞、内皮细胞摄取。将其作为生物墨水添加剂融入明胶-海藻酸盐支架后，未显著改变墨水的机械性能和打印适性，且能持续释放（72 h累积释放率≈80%）。体内实验表明，搭载M2-EVMs的支架可使纤维包膜厚度降低58%，血管密度增加3倍，显著促进皮肤伤口的上皮化、毛囊再生及血管形成。本研究证实M2-EVMs通过调控免疫微环境和促进血管化，显著提升了3D打印组织的宿主整合能力，为解决生物材料植入后的炎症和再生难题提供了新途径。

文章来源：
https://doi.org/10.1088/1758-5090/add49f