Biomaterials：3D打印构建2型糖尿病体外皮肤模型

来源：EngineeringForLife

皮肤健康问题是2型糖尿病的首发可见症状。2型糖尿病可导致一系列的皮肤问题，比如：糖尿病皮肤病、水泡、皮疹、瘙痒和真菌感染等。这种情况发生在机体对胰岛素无法正常反应或不能产生足够的胰岛素来维持正常的血糖水平时。特别是长期糖尿病并发症合并高血糖状态。进入皮肤的血液循环减少会损害细胞功能，最终导致自我修复困难。由于伤口愈合的延迟，皮肤损伤的糖尿病人患者具有高感染风险。14% - 24%的患者需要截肢，其中85%是在脚底(称为糖尿病足溃疡)。尽管如此严重，据报道糖尿病相关的皮肤病仍然没有很好的治疗方法。

前人主要应用糖尿病动物模型来进行糖尿病皮肤病的研究，但是动物模型的伦理问题以及动物基因组与人类基因组的差异导致该模型并不能十分合理的预测其方法的准确性。近期，来自韩国浦项科技大学的Dong-Woo Cho教授团队在Biomaterials上发表了题目为Engineering of diseased human skin equivalent using3D cell printing for representing pathophysiological hallmarks of type 2diabetes in vitro的文章，应用3D打印技术体外构建了具有糖尿病病理特征的皮肤模型。

尽管已有许多关于体外构建皮肤模型的成果，但未有人报道过体外皮肤疾病模型。因此，研究人员通过3D细胞打印主要皮肤层(表皮、真皮层、皮下组织和血管)和利用天然皮肤中发现的生理现象来建模具有明确2型糖尿病属性的患病皮肤。图1显示了这项研究的一些重点和工作流程。

图1 本研究的一些重点和工作流程

尽管3D皮肤打印技术已取得了许多重大进展，但尚未有皮肤病理模型报道。因此，研究人员基于3D细胞打印技术在体外建立具有2型糖尿病病理生理特征的3D病变皮肤组织。为了克服糖尿病角质形成细胞分化能力差的问题，研究人员利用在天然皮肤中发现的表皮-真皮胞间通讯的作用，假设糖尿病成纤维细胞(dHDFs)可以诱导正常角质形成细胞(nHEKs)成为糖尿病型表皮细胞。为了证明这一假设，研究人员分离dHDFs，并从组织学和基因表达的角度进行分析。研究人员首次将可打印聚己内酯(PCL)纳入3D细胞打印的损伤皮肤模型中，使之成为一个3D transwell系统。在糖尿病皮肤模型中观察到糖尿病皮肤的重要特征：延迟再上皮化。为了进一步增强结构相似性和糖尿病特性，该研究在真皮层下面添加了含有糖尿病人脂肪细胞和可灌注血管通道的皮下层。在该糖尿病皮肤模型中发现了胰岛素抵抗增加、血管功能障碍、脂肪肥大和促炎症反应等糖尿病特征。最后，为了证明构建的糖尿病皮肤在皮肤病学研究和药物测试方面的潜在应用，研究人员将试验药物（二甲双胍/EPA）应用于血管通道3天。观察表皮的功能恢复和炎症反应的减少。

图2 分析dHDFs与nHDFs细胞之间的差异：nHDFs较dHDFs的迁移能力强，COL I表达量更高。

图3 利用3D打印技术结合PCL小室构建正常皮肤模型和糖尿病皮肤模型：图A-B显示成熟3D皮肤模型及其HE染色结果，据统计，糖尿病皮肤的表皮厚度较正常皮肤模型表皮厚度薄1.52倍；图D利用基因分析技术统计了分化标记物(K10: keratin10, IVL: involucrin) 和糖尿病相关标记物表达量之间的差异(IR: Insulin receptor,TNF-α: tumor necrosis factor-alpha)，符合糖尿病皮肤的蛋白表达状态；图E结果显示，由dHEKs和dHDFs组成的皮肤模型的接触角(测量值约为21°)与糖尿病皮肤模型的接触角(测量值约为19°)没有差异；图F-H表明糖尿病模型创口恢复能力延迟，符合糖尿病皮肤特征。

图4 应用同轴挤出打印方式在3D打印糖尿病皮肤模型中添加血管结构，并在结构下方增加皮下脂肪层结构：图A显示整体打印流程；图B显示灌流过程；图C显示其内部形成的血管结构；图D显示葡萄糖摄取结果，糖尿病皮肤模型有胰岛素抵抗现象；图E显示在高糖状态下，脂肪细胞中脂滴更大；图F显示不同糖浓度培养条件下TNF-α、IL-6、ROS的表达量随时间逐渐增加，高糖环境三者的表达量更高；图G表示 FITC标记的右旋糖酐注入血管流道10分钟。荧光图像显示高糖状态下糖尿病皮肤模型较正常皮肤模型具有较低扩散渗透性。这表明内皮屏障将被建立的高血糖条件削弱。该模型可以通过高血糖条件进一步反映糖尿病的主要特性，包括脂肪细胞萎缩、血管功能障碍、炎症反应和胰岛素抵抗。

图5 糖尿病皮肤模型的潜在应用探索。将二甲双胍或二十碳五烯酸（EPA）通过血管组织进行灌流操作；机制层面：由于鞘糖脂累积，糖尿病角质细胞层的胰岛素受体（IR）会关闭。图C共聚焦图片显示胰岛素受体磷脂（p-IR）在经过二甲双胍处理后与正常水平相似。图D葡萄糖摄取实验显示实验组中存在胰岛素抵抗现象；图E表示在EPA治疗后糖尿病皮肤模型的炎症反应降低。

本文首次应用3D打印技术构建糖尿病皮肤模型，并通过胞间通讯的作用原理利用dHDFs将nHDFs诱导成为dHDFs，使之成为与糖尿病患者皮肤类似的体外病理模型。通过添加皮下脂肪层与血管结构构建灌流通道，为后续药物评估建立便捷条件。增强的糖尿病皮肤模型包括糖尿病的典型特性，如胰岛素抵抗、脂肪细胞肥大、炎症反应和血管功能障碍。此外，研究人员通过将糖尿病相关药物导入皮肤模型的工程血管，验证了其作为药物筛选和新进展的疾病模型的可行性。

论文链接：
https://doi.org/10.1016/j.biomaterials.2021.120776