大阪大学的Shinji Sakai团队：可见光交联甜菜果胶助力3D生物打印

来源： EngineeringForLife

甜菜果胶（SBP）通常由甜菜糖生产的废弃副产品制成，主要由甲基酯化的 α-(1,4)连接的半乳糖醛酸组成。SBP还含有酚类，SBP可以很容易地用于可见光介导的酚类交联在三维生物打印系统而没有化学修饰。然而，目前还没有关于SBP通过光交联进行水凝胶化的报道，也没有研究SBP作为生物油墨材料在3D生物打印中的应用。

近日，来自大阪大学的Shinji Sakai团队使用可见光介导的光交联系统来获得SBP水凝胶（图1a-b），使用含有细胞的SBP水凝胶研究了SBP和光交联系统对细胞活力的影响。此外，使用基于挤压的打印系统（图1c）证明了由人肝母细胞瘤(HepG2)细胞，SBP，三（联吡啶）氯化钌（II）六水合物（[Ru（bpy）3]2+）和过硫酸钠（SPS）组成的生物墨水的3D生物打印。这种相关论文“Visible light photocrosslinking of sugar beet pectin for 3D bioprinting applications”于2023年5月15日在线发表于杂志《Carbohydrate Polymers》上。

图1 用于3D生物打印应用的甜菜果胶的可见光光交联

1. SBP的表征和SBP溶液的粘弹性
首先，研究者通过核磁共振和紫外-可见光谱确认了阿魏酸的存在（图2a-b）。粘弹性对于制造具有良好形状保真度的3D结构至关重要，1.0、3.0和6.0 wt% SBP的粘度剪切速率曲线如图3所示，增加SBP浓度会增加SBP溶液的粘度。SBP溶液在较高剪切速率下的粘度降低可归因于聚合物链的排列。

图2 SBP的基础表征

图3 SBP 溶液的粘度-剪切速率曲线

2. SBP水凝胶的形成
接下来，通过光交联值得了SBP水凝胶。为了确认交联机理，使用荧光光谱法分析了SBP水凝胶中的二苯酚形成。如图4a所示，在SBP水凝胶中观察到约420 nm处的荧光峰，对应于二苯酚的形成。这一结果表明，可见光介导的SBP水凝胶反应确实是由SBP中苯酚基团之间的交联引起的。

为了进一步评估水凝胶过程，在可见光照射下进行了流变测量。存储模量（G'）仅在将可见光施加到溶液上时才增加（图4b）。该结果表明，通过调整可见光的照射，交联的简便性和精确控制。

图4 SBP水凝胶的交联机理探究

凝胶时间随可见光强度的提高而减少，高于153 W/m2时凝胶时间无明显差异（图5a）。后续均采用153 W/m2的可将光进行实验，通过增加SBP（图5b）和SPS（图5c）的浓度观察到更短的凝胶时间。同时，增加[Ru（bpy）3]2+浓度从0.5到4.0 mM显示凝胶时间没有显着变化（图5d）。总体而言，SBP水凝胶在60 s内形成，在SBP浓度为6.7 wt%时观察到的最短凝胶时间为6.0 s，使用SPS和[Ru（bpy）3]2+浓度为1.0 mM。

图5 可见光强度和药品浓度对水凝胶成型的影响

3. SBP水凝胶的力学性能

机械性能分析显示，随着照射时间从10分钟增加到20分钟，杨氏模量更高（图6a），照射30分钟无进一步增加。基于该结果，研究者使用30分钟的照射时间来评估水凝胶的杨氏模量。通过将SBP的浓度从0.005增加到1.0 wt%（图6b）和SPS从0.6增加到0.3 mM（图1c），观察到杨氏模量（p < 0.6）显着增加。与此同时，[Ru（bpy）3]2+浓度对水凝胶的杨氏模量没有显著影响（图6d）。结果表明，SBP和SPS浓度是水凝胶化的关键因素。

图6 SBP水凝胶的力学性能

4. 挤出印刷系统中的印刷适性评估
然后，研究了SBP生物油墨在挤出印刷体系中的适印性。将流速从1.2增加到2.0 μL/s可产生更宽的线（图7a，d）。较低的流速会导致挤出缓慢，而较高的流速会导致油墨挤出过多，从而导致印刷适性降低。随后，研究了不同SPS和SBP浓度的油墨的印刷适性。0.3–0.5 mM的SPS浓度导致宽线宽和低保真度结构，而在767.1 mM的SPS浓度下观察到较小的线宽和良好的保真度构建（图7b，e）。与使用4.0 mM SPS制造的相比，进一步将SPS浓度增加到0.05 mM的线宽没有显着差异，并且构建体的保真度没有明显变化（图7b，e）。因此，1.0 mM的SPS浓度足以用于挤出印刷。

通过将油墨中的SBP浓度从1.0%增加到6.0wt%获得了更小的线宽（图7c，f）。使用含有1.5 wt%（图8 c）和3.0 wt%（图8 d）的SBP浓度的生物墨水获得了基于蓝图制造的具有6 mm高度的良好保真晶格结构（图8a）。而含有1.0wt%SBP的墨水没有按照蓝图形成结构，因此，SBP浓度为3.0和6.0 wt%用于制造各种结构（图8）。

图7 流速、SPS浓度和SBP浓度对3D结构线宽的影响

图8 使用挤出印刷系统制造的各种SBP结构

5. SBP水凝胶对细胞活力的影响

接下来，研究者评估了包封在SBP水凝胶中对HepG2细胞活力的影响。如图9所示，无论浓度如何，HepG2细胞在SBP水凝胶中都显示出低PI染色细胞的存在，从培养的第1天到第7天保持。这一结果表明SBP与HepG2细胞的细胞相容性。

图9 SBP水凝胶对细胞活力的影响

6. 3D生物打印
文章最后，研究了该系统用于3D生物打印的可行性（图10）。从打印后第0天到第14天，PI染色细胞的存在变化最小（图10b）。此外，还观察到SBP构建体中HepG2细胞的线粒体活性增加（图10c）。与2.3 wt% SBP中HepG2细胞相比，6.0 wt% SBP细胞的线粒体活性更高，在第3天和第0天在7.14 wt% SBP构建体中观察到细胞聚集体（图10b），可能表明水凝胶中的细胞生长。

图10 3D生物打印

综上，本文报道了通过光交联制备SBP水凝胶及其在3D生物打印中的应用。该水凝胶可以应用于3D生物打印，并且打印在水凝胶中的HepG2细胞保持了14天的活力。此外，HepG2细胞显示出线粒体活性的增加，这与聚集体的形成相结合，表明细胞在水凝胶中的生长。总的来说，SBP和可见光交联体系在生物医学和组织工程应用中很有前途。

文章来源：https://doi.org/10.1016/j.carbpol.2023.121026