丝素蛋白水凝胶的凝胶动力学、形成机制、功能化及 3D 生物打印在生物医学中的应用

来源：EFL生物3D打印与生物制造

丝素蛋白（SF）源自蚕茧纤维，具有生物相容性、可降解性和可持续性，其可加工成多种材料形式，在生物医学领域有广泛应用，其中丝素蛋白水凝胶因可通过调控凝胶过程实现结构和性能的定制，在组织工程等领域颇具价值。然而，丝素蛋白水凝胶存在凝胶速度慢和生物惰性等限制其应用的问题。来自迪肯大学的Jing-Liang Li教授、墨尔本大学的David R. Nisbet教授以及Linpeng Fan团队综述了丝素蛋白水凝胶的形成、凝胶机制、动态控制和功能化等研究领域进展，从分子组装和结晶的角度深入探讨了调控丝素蛋白凝胶动力学的策略和机制，还介绍了功能化途径及3D打印丝素蛋白水凝胶的实际案例以说明这些策略、机制和途径的具体应用。相关工作以“Gelation Dynamics, Formation Mechanism, Functionalization, and 3D Bioprinting of Silk Fibroin Hydrogel Materials for Biomedical Applications”为题发表在《ACS Nano》上。

图 1. 丝素水凝胶形成过程与应用之间的关系。

研究内容
1. 丝纤维和丝素蛋白结构示意图，通过扫描电镜观察、氨基酸序列分析及分子动力学模拟，研究了天然蚕丝纤维及丝素蛋白（SF）的多层次结构。结果表明，蚕丝纤维由两根包裹丝胶的SF长丝组成，单根长丝由纳米原纤束构成；SF分子含重链（~391 kDa）、轻链（~25 kDa）和糖蛋白（~30 kDa），重链中甘氨酸（45.9%）、丙氨酸（30.3%）等形成的重复序列模块（如GAGAGS、GAGAGY）通过氢键驱动β-折叠结晶区形成，疏水区模块（i、ii）与亲水区模块（iv）的协同作用决定了分子组装行为。   

图2. 丝纤维和丝素蛋白结构示意图。   

2. 丝素蛋白水凝胶通过分子组装和结晶过程的形成示意图，利用时间分辨圆二色光谱（CD）、傅里叶变换红外光谱（FTIR）及透射电镜（TEM），研究了SF水凝胶的凝胶化机制。结果表明，凝胶化过程分为“成核-生长-网络稳定”三阶段：SF分子先自组装形成β-折叠晶核，随后晶核生长为纳米纤维并分支形成单域纤维网络，最终通过氢键、疏水作用和静电作用交联成三维凝胶；凝胶动力学受SF浓度（如7.2 wt% SF凝胶时间比0.6 wt%缩短7天）和分子量调控，高浓度或高分子量加速β-折叠聚集。   

图3. 丝素蛋白水凝胶通过分子组装和结晶过程的形成示意图。   

3. 调节丝素蛋白水凝胶凝胶动力学的方法示意图，采用溶液化学调控（pH、离子强度、添加剂）、物理刺激（超声、涡旋）及界面工程，研究了加速SF凝胶化的关键策略。结果表明：① pH调节至等电点（3.8-3.9）时，电荷中和使凝胶时间缩短至数小时；② 阳离子表面活性剂（如SDS，8-12 mM）通过静电屏蔽和疏水诱导，将凝胶时间从8天缩短至15-18分钟；③ 超声处理（20-30秒）通过破坏分子内氢键促进β-折叠形成，使凝胶时间降至分钟级，但高能量超声可能损伤细胞；④ 二元溶剂（如正丁醇）通过脱水作用加速分子聚集，10%正丁醇可使凝胶时间缩短至39.6分钟。   

图4. 调节丝素蛋白水凝胶凝胶动力学的方法示意图。   

4. 丝素蛋白的结构转变和凝胶化机制示意图，结合酶催化（辣根过氧化物酶/过氧化氢体系）、光引发聚合（甲基丙烯酰化SF）及动态流变学测试，研究了化学交联对凝胶动力学和机械性能的影响。结果表明：① 酶催化氧化酪氨酸残基形成二酪氨酸交联，凝胶时间可控制在分钟级，且交联密度影响储能模量（G'）；② 光引发交联（UV照射365 nm）使甲基丙烯酰化SF在10分钟内形成稳定水凝胶，打印结构（如仿生气管）的压缩模量达11.55 MPa；③ 动态共价交联（如 Genipin）结合β-折叠结晶，可同步提升凝胶强度和生物相容性。   

图5. 丝素蛋白的结构转变和凝胶化机制示意图。   

5. 基于丝素蛋白生物墨水可调凝胶过程制备丝绸支架的3D打印系统示意图，通过数字光处理（DLP）、挤出式生物打印及原位交联技术，研究了SF生物墨水在复杂结构制造中的应用。结果表明：① DLP技术利用甲基丙烯酰化SF光交联，可打印分辨率达100 μm的血管网络和心脏模型，支持软骨细胞黏附与分化；② 挤出式打印结合钙离子触发交联，可制造含梯度孔隙的骨组织工程支架，与生物玻璃复合后促进成骨细胞矿化；③ 原位打印系统（如FRESH技术）通过可逆嵌入悬浮水凝胶，实现低黏度SF墨水（10% w/w）的3D结构成型，细胞存活率超90%。   

图8. 基于丝素蛋白生物墨水可调凝胶过程制备丝绸支架的3D打印系统示意图。   

6. 用于生物医学应用的丝素蛋白生物墨水3D打印分层结构示意图，借助细胞共培养、体内植入实验及免疫荧光染色，研究了3D打印SF支架的生物医学性能。结果表明：① 打印的仿生气管植入兔模型后，软骨缺损处可见新生组织形成，II型胶原表达显著增加；② 含RGD肽修饰的SF水凝胶促进血管内皮细胞黏附，体内诱导毛细血管生成；③ 负载抗肿瘤药物的SF纳米颗粒复合水凝胶，可抑制小鼠皮下肝癌肿瘤生长，CD44+ CD133+肿瘤细胞减少60%以上。   

图9. 用于生物医学应用的丝素蛋白生物墨水3D打印分层结构示意图。

研究结论
本研究聚焦于丝素蛋白水凝胶，全面综述其形成、凝胶机制、动态控制及功能化。研究发现，丝素蛋白的分子结构（如重链重复序列和疏水区）是凝胶化和功能化的基础，其凝胶过程通过分子组装和结晶实现，可通过调节浓度、pH、离子、表面活性剂等加速凝胶动力学。功能化策略包括化学修饰、纳米粒子添加和转基因技术，赋予水凝胶抗菌、促细胞黏附等特性。3D生物打印技术结合动态凝胶控制，成功制备复杂仿生结构，用于软骨、骨组织再生等领域。尽管丝素蛋白水凝胶在生物相容性和可调控性上优势显著，但其批次间分子量差异、规模化生产及体内安全性仍需进一步研究，未来发展方向包括智能化功能整合与精准生物制造。

文章来源：
https://doi.org/10.1021/acsnano.4c18568